Егоров - Основы учения об антибиотиках - 1986 (947288), страница 90
Текст из файла (страница 90)
Существенное внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс непогашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента антибиотика в ферментере. Основная причина появления большого количества пены — наличие белковых веществ в срсде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментерах при антибнотикообразованин используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жнр), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафпновое), спирты и высшие жирные кислоты.
Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, дназобуталкарбамил и другие соединения). Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания.
Прн атом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасятеля может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, может отрицательно сказаться на развитии микроорганизма н его биосннтетической активности.
Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены сильными струями жидкости, пара нчи газа). Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения н химической очистки представлена на рис. 65. 14 — 742 417 Рис. бб. Схема производства антибиотиков: 1 — приготовление посевного материала, Ц вЂ” нноиуляторы для нерапгнванзтя посевного материала. Ш вЂ” стерилизатор среды длп болыпого ферментера, Лт — установка для бносинтезв антибиотика (по Койег, 19бб): в — стерилизации сржды в волбах.
б-охлаждение н посев «уль. турм вродуцентл в колбу. и — рост культуры в ноксе. з рост культуры в качалке, д - ижжулнтор со стерильной срелой, з— инокулнтор со срелой, засенвной культурой дродуцента. ж — фильтры н компрессор, з — резервуар со сжатым воздухом, и — нагрев воздуха. и — ферментер, л — рубаюка здв езлажлавни ферментера 'ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ХИМИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА АНТИБИОТИКОВ В процессе развития микроорганизмов образуемые ими антибиотики в большинстве случаев почти полностью выпаля)отея из клеток в окружающую среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость выделяется лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток.
У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма. В зависимости ат того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, не сь1ешивающимися с жилкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами.
Выделение антибиотика из клеток микроорганизмов осуществляют с помощью экстракции органическими растворителями. В случае, если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральиой жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют. Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования.
Для процесса фильтрации применяют фильтрующие аппараты: фильтр- пресс, путч-фильтр, друк-фильтр, центрифуги, сепараторы. Фильтр-прессы применяются для обработки больших объемов культуральнай жидкости. Аппараты состоят из ряда чередующихся плит и рам и фильтрующих перегородок между ними. Процесс фильтрации осуществляется под давлением. Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют путч-фильтры или друк-фильтры. Первый аппарат работает под вакуумом, а в друк-фильтре процесс фильтрации осуществляется благодаря созданию давления над фильтрую.
щей жидкостью. Широкое распространение в получении жидкости, освобожденной от взвешенных частиц, получил способ центрифугирования. Хорошие результаты получаются в том случае, когда при правильном выборе скорости подачи жидкости скорость вращения центрифуги достигает 15 000 об/мин.
Отделение мицелия нли других взвешенных частиц можно также производить в сепараторах. При скорости вращения барабана сепаратора 7000 †75 об/ /мин, благодаря центробежной силе твердые частицы устремляются к стенкам барабана и осаждаются там, а отсепарированпая жид- 419 кость стремится к центру барабана и поднимается вверх в специальную камеру. Е1ель химической очистки — извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение (собственно очистка) от сопутствующих примесей н в конечном счете получение высокоочншенного препарата, пригодного для соответствующего применения. Антибиотическне вещества под влиянием жестких внешних факторов (повышенной температуры, высокой кнслотности нли щелочиости и др.) в ряде случаев теряют свои свойства, ииактивируются.
Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности. Основными методами очистки антибиотиков являются следующие. Метод экстракции. Нередко в целях очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией).
Такой прием носит название перекрнсталлизацин. Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускаиии водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами. основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующнмн понообменными смоламн оии сорбнруются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда их ионов называют катнонитамн нли анионитами. Антибиотик (как отрицательно заряженный иои) будет сорбироваться на катиоиитной смоле н наоборот Адсорбированный на смоле антибиотик элюируют (десорбируют), в результате чего получают значительно очищенный и концентрированный препарат. Затем раствор этого препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд.
При этом на смоле осядут примеси, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку. Метод осаждения. Антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок; последний с помощью фильтров или центрнфугирования отделяют от нативиого раствора, промывают и в ряде случаев высушивают. Образовавшееся соединение растворяют н антибиотик зкстрагируют нли вновь осаждают (кристаллизуют). Одна из стадий химической очистки антибиотиков — концентрирование полученных растворов; достигается отгонкой большей части растворителя, как правило, в высоком вакууме.
Применяемые методы выделения и химической очистки, а также качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение прежде всего для улучшения качества получаемого антибиотика и увеличения выхода препарата. 420 сиикл, контроль и рлсфлсовкл првплрлтл После выделения и химической очистки антибиотика его необходимо высушить, т. е.
удалить из полученного препарата свободную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков в той нлн иной степени термолабнльны, для их высушнвания необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности, не изменяющие цвета препарата На современном этапе промышленного получения антибиотиков используют методы обезвоживания препаратов. Лио4ильная сушка антибиотиков — широко распространенный прием; проводится при сравнительно низких температурах ( — 8.
— 12'С). Высушивание с применением раслылительной сушилки — прогрессивный метод прн работе с большими количествами антибиотика; раствор антибиотика пневматичесни распыляется до мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушнвания аитнбнотинов протекает в течение нескольких секунд. Прн этом даже термолабильные препараты не меняют свойств.
Метод взвешенного слоя нли сушка в вакуумсушильных шкафах применяется для высушнвання зернистых и пастообразных аитнбиотнческих препаратов. Контроль препарата. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю; биологическому н фармакологическому. Биологический контроль ставит задачей выяснение стерильности готового препарата. Для этого используют, кан правило, два метода.
Первый — связан с инактивацией антибиотика н высевом его в соответствующую питательную среду. Например, биологический контроль бензнлпенициллнна и полусннтетнчесних препаратов, полученных на его основе, производится следующим образом. В пробирки, содержащие тноглинолевую среду, вносят фермент пенициллнназу в количестве, способном полностью ннактивировать пенициллин. Пробирки с пенициллиназой выдерживают 2 — 3 сут при температуре 37'С для контроля стерильности фермента, затем в них вносят раствор пенициллина. Пробирки разделяют на две группы: одну выдерживают при 37; а другую — прн 24' в течение 5 сут. Ведут ежедневное наблюдение за возможным развитием микроорганизмов.
Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяется тем, что для большинства этих соединений не имеется биологических ннактнваторов их биологической активности. Поэтому у изучаемых препаратов выявляют наличие устойчивых и ним форм микроорганизмов, а также определяют возможное присутствие чувствительной минрофлоры. Лля определения возможного присутствия в таких препаратах чувствительной к ним микрофлоры раствор антибиотиков пропускают через мембранные фильтры с диаметром пор пе более 0,75 мн. 421 Необходимо подчеркнуть, что стерильность готового антибиотика обеспечивается соблюдением стерильных условий работы на всех стадиях процесса развития продуцента, выделения н очистки препарата.
Фармакологический контроль. К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, в соответствии с Государственной фармакопеей СССР предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность н на другие жизненно важные функции организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности (влияние на кровь, центральную нервную систему, дыхание и т.
д.). Показатели острой токсичности являются одним из критериев качества антибиотического вещества. Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД) антибиотика, дозу, вызывающую гибель 50ть подопытных животных ((.Огь), н смертельную дозу (ЕОке). Только после всестороннего и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению. Расфасовка и упаковка антибиотика †следующ этап работы. Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической активности, даты выпуска н срока годности поступает в продажу.
АКТИНОФАГИЯ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В ПРОИЗВОДСТВЕ АНТИБИОТИКОВ В природе широко распространены фаги, вызывающие лизис актиномицетов, или актинофаги. Они довольно легко обнаруживаются в различных типах почв. Наибольшее количество актинофагов выделяется из черноземной, перегнойной и подзолистой почв. Впервые явление лизиса актниомицета под действием фатов было обнаружено Дмитриевым в 1934 г:, исследователь наблюдал ливис мицелия 51гер1отусез Ьоо1з при выращивании его на жидких средах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
