Егоров - Основы учения об антибиотиках - 1986 (947288), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Процесс днссоциации Вас. Ьгеп1з в большой степени зависит от условий культивирования: состава среды, источников углерода, азота, рН и других факторов. Однако любое изменение условий культивирования всегда приводит к возникновению четырех вариантов Вас. Ьгепьч: К, 8, Р+ и Р-. Новые варианты Вас. Ьгеви, появившиеся в процессе диссоциацнн, имеют признаки, отличные от признаков исходной культуры, и в том числе способность к образованию антибиотиков. Образовывать грамицндин С могут лишь две формы: К и Р+, формы $ и Р- не способны продуцировать этот антибиотик. Биосинтез грамицидина С антнбиотикообразуюшими вариантамн (11 и Р+) Вас.
Ьгевгз происходит независимо от процесса спорообразования: антибиотик синтезируется как в процессе споро- образования (по-видимому, на стадии проспоры), так и активно размножающимися клетками. Б период, когда культура переходит к массовому спорообразованню, биосинтез грамицидина не происходит. Отличие грамицидина С от тиротрицина обнаруживается уже при выделении антибиотика.
Грамицидии С при упаривании спиртового экстракта, полученного из бактериальной массы, легко превращается в игольчатые кристаллы. Тиротрицин в аналогичных условиях — аморфный препарат. 171 Грамицидин С существенно отличается от грамицидина Сп по аминокислотному составу. Так, в грвмицидиие С имеется 10 аминокислотных остатков пяти аминокислот, составляющих замкнутый цикл, а грамицидии Сп состоит из 15 амииокислотных остатков шести аминокислот, расположенным линейно (не циклически). Условия образования Грамицидин С длительное время получали при выращивании Вас. Ьгеиз чаг.
О. В. на средах, содержащих мясной гидролизат, или иа 10%-иом дрожжевом гидролизате при поверхностном культивировании организма при температуре около 40 С. В этих условиях образуется до 2000 мкг/мл грамицидина. Коршуновым еше в 1962 г. была установлена принципиальная возможность хорошего роста организма с образованием антибиотика при глубинном культивировании бактерии в колбах ва качалках или при продувании воздуха в опытных стеклянных ферментерах. Интенсивность аэрации среды для развития Вас. Ьгеп(з чаг.
О. В. играет существенную роль в образовании грамицидииа С. При низкой степени аэрации среды (0,38 г(Ог/л/ч) культура бактерий плохо развивается и слабо синтезирует антибиотик. Это связано, по-видимому, с недостатком кислорода в среде. Повышение интенсивности аэрации до 4,38 г/О,(л(ч способствует увеличению скорости роста бактерий и активному потреблению основных комйонентов субстрата, что в итоге также приводит к снижению образования грамицидина С. Для максимального накопления биомассы бактерий и биосиитеза антибиотика необходимо подобрать сбалансированное сочетание интенсивности аэрации среды и концентрации входящих в нее веществ.
Источники азота и углерода при этом должны содержаться в среде в некотором избытке. Было показано, что Вас. Ьгеп(з иа высоком уровне образует грамицидии (до 2500 мкг/мл) при культивировании его на относительно простой синтетической среде (янтарнокислый аммоиий— 0.57р, глицерин — 1,5%; Мп504 — 0.02'$; КзНР04 — 0,2%; вода дистиллированная; рН среды перед посевом 7,0 — 7,3). Увеличение концентрации неорганического источника фосфора в среде существенно не влияет на биосинтез грамицидина.
Развитие Вас. Ьгеп(з и образованяе грамицидина С можетпроисходить как при температуре 28 С, так и при 40'С. Однако в последнем случае максимальное образование антибиотика происходит в первые 24 ч развития культуры, а при температуре 28'С— в период между 24 и 48 ч. Добавление к натуральной среде неопределенного состава, состоящей из дрожжевого экстракта, мясного экстракта, бактопептона и глюкозы, меченых по углероду "С аминокислот, входящих в состав молекулы грамицидина С, показало, что каждая из пяти аминокислот довольно быстро включается в пептидный цикл моле- 172 кулы антибиотика.
Структурные аналоги этих аминокислот подавляли образование антибиотической активности, мало затрагивая при этом рост организма и синтез белка, На синтетической среде в присутствии фенилаланина происходит увеличение биомассы бактерий в 1,5 — 2 раза и повышение биосннтеза грамицидина С в 5,4 раза у К-формы яо сравнению с контролем (среда без фенилаланина) н в 3,8 раза у Р+-формы. Интересно, что аналог фенилаланина ~-феиил-~-алании полностью подавляет антибиотикообразование у и-форм и значительно угнетает рост всех форм изученной бактерии. С другой стороны, дериваты пиримидина (в особенности 5-бромуридин) и б-флуоротриптофан разъединяли синтез белка и грамицидина в другом направленин, т.
е. в культурах, которые содержали эти компоненты, продолжа,яось накопление антибиотика, а рост и синтез белка почти приостанавливался. Следовательно, механизмы синтеза грамицидина и белка в организме различны. Некоторые аминокислоты (лейцнн и пролин), внесенные в казеиново-дрожжевую среду, содержащую 30 мгЪ )ч, несколько повышают выход антибиотика. Однако образование грамнцидина в этом случае не достигает уровня биосинтеза антибиотика иа той же среде, но содержашей 120 мгЪ азота.
Валин и орнитин способствуют в условиях обедненной по азоту среде более высокому уровню образования антибиотика по сравнению со средой, содержащей лейцин и пролнн. На синтетической среде с глицерином (2~) внесение в субстрат сочетаний яблочной и фумаровой кислот с р-фенил-а-аланином обеспечивает наибольший биосинтез грамицидина С. Добавление к среде треонина приводило к некоторому снижению роста К-формы и одновременному повышению биосннтеза антибиотика этой формой Вас. Ьгеои примерно на 20'то, а у Р+-форм в прнсутствии треонина происходит полное угнетение образования грамициднна. Прнведенные наблюдения показывают, что на биосинтез грамицидина С существенное влияние оказывают некоторые аминокислоты.
Так, р-фенил-а-алании заметно стимулирует образование антибиотика, тогда как ее ближайший аналог р-фенил р-алании выступает в роли мощного ингибнтора биосинтеза молекулы грамицидина С. Одна и та же аминокислота в зависимости от штамма продупента оказывает стимулирующее или ингибируюшее действие. Грамицидин С синтезируется клетками Вас. Ьгео1з при участии двух ферментов (грамицидин-синтетазы 1 и 11) в присутствии АТФ и ионов Мй'+. Компонент 1 осуществляет активацию четырех аминокислот, входящих в молекулу грамицидина С. Для каждой аминокислоты у этого фермента имеется свой активный центр. Процесс активации аминокислот происходит по следующей схеме: вначале идет образование аминоациладенилатов, связанных с компонентом 1, затем происходит отшепление АМФ, и аминокислоты переносятся на сульфгидрильные группы фермента.
Компонент П вЂ” рапемаза фенилаланина активирует фенилаланпн также в присутствии АТФ и ионов магния, в результате чего образуется аминоациладенилат, который переносится на сульфгидрильиую группу компонента П с образованием тноэфира 0-фенилаланина Образование пептидиых связей между активированными аминокислотами происходит с участием фосфопантетепна, ковалентно связанного с компонентом 1. Перенос 0-феиилаланина с компонента 11 на иминную группу 1.-пролнна идет без участия фосфопантетеина. Биосинтез дипептида (фенилаланин — пролив) — это первая стадия образования полипептидного антибиотика.
Образовавшийся дипептид переносится на фосфопантетеин, с помощью которого осуществляется перенос этого дипептида на аминную группу 1.-валина. Образуется трипептид: фен — про — вал. Трипептнд переносится на аминную группу орнитина с образованием тетрапептида: фен — про — вал — орн, который тем же путем переносится на амиииую группу лейцина с образованием пентапептида: фен— про — вал — орн — лей. В результате процесса происходит циклизация пентопептнда с образованием грамицидина С. Грамицидин-синтетазы образуются в период развития культуры„следующий за лаг-фазой, и активность их быстро уменьшается, когда клетки переходят к стационарной фазе развития. Грамицндин С начинает обнаруживаться через несколько часов после начала проявления активности ферментов.
Образование антибиотика продолжается н после прекращения активности ферментов в культуральной жидкости. Грамицидин-синтетизм могут находиться как в растворимой, так и в связанной с мембранами формах. Последняя форма более устойчива, и она, по-видимому, ответственна за образование антибиотика после инактивации растворимой синтетазы. Выделение грамнцидина С Выделение грамициднна С производят следующим способом. Культуральную жидкость подкисляют соляной кислотой до рН 4,5 — 5. При этом в осадок выпадают дихлоргидрат грамицидина С и бактериальные клетки продуцента, затем антибиотик нз осадка экстрагируют спиртом.
Полученный концентрат, содержащий до 4эй грамицидина, используют в медицннской практике„ Спиртовой концентрат содержит помимо грамицидина С еще несколько близких соединений. Аптимнкробный спектр н применение Грамицидии С обладает довольно высокой аитибиотнческой активностью в отношении грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий. 174 иоееттеиоаоооет тттеае камтаеотатттие зтзт1ие Ваыциз иты1!1з...
Еесаелсжа ат!1.... Васзетгити аузеи1епат Вас!ее!чти рата!урж А. Вас! ии 1урж... С!оззтгтзити ше!сад !Хр!ососсиз раеитиои!ае Мгстососсиз зриотт!тоссе тн1стосОтззтз тииййзтадтз Ртогеиз ои!2атгз . В1ара1!онассис аитеиз 31ар!и'!ососсиз руокеаез !Π— !б 2 !2 бО 50 7 ю 5 б 50 3 — !2 З вЂ” гй Антимикробный спектр грамнцндина С отличается от спектра тиротрицина и его компонентов широтой действия.
Антибиотические свойства грамицндина С сохраняются в присутствии лимфы, сыворотки крови н гноя. Грамицидин С находит применение в хирургии при первичной обработке ран, при лечении инфицированных ран, ожогов и других нагноительных процессов. Антибиотик применяют, в акушерско-гинекологической практике при лечении эрозий шейки матки и кольпитов. Химическое строение и синтез 175 Химическая природа грамицидина С хорошо изучена. Это позволило Швайзеру н Зиберу в 1956 г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
