Егоров - Основы учения об антибиотиках - 1986 (947288), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Л. А., Тарасевнча (ГКИ); стакдарты соответствуют 5, 9, 10 и 11 едннйцам мутности. В качестве единицы мутности условно принята мутность взвеси тифозных бактерий, содержащая !00 млн. микробных тел в 1 мл. Однако прн определении биологической активности антибиотиков в качестве тест- организмов чаще всего используют другие микробы, величина числового эквивалента мутности которых обычно ие соответствует величине числового эквивалента мутности тифозных бактерий.
Разработаны соответствующие поправки, которые необходимо вносить при использовании взвеси спор тест-организмов в процессе определения биологической активности антибиотиков. Поправки по отношению к числовому эквиваленту мутности для взвесей тифозных бактерий следующие: Споры 1. (типа Вас,аиЬШи) ....... 1/12 Споры Вас. мусоп/еа ........... 1/6 Споры;Нас.
спусс/Ееа (гааапвй париаит) .. 1/З Зная эти поправки, можно рассчитать число спор в 1 мл суспензпи. Пример расчета. Допустим, что плотность взвеси спор Вас. эиЬВВэ соответствует 5 едшшцам мутности стандарта ГКИ. Зная, что числовой эквивалент укаэанной мутности для взвесей тифозных бактерий составляет 100 млн/млХ5=500 млн/мл п что соответствующий эквивалент для взвесей спор Вас.
пиЫ(//з в 12 раз меньше, находим, что концентрация спор в исследуемой суспензия равна 500 мли/мл: 12ж 42 млн/мл. Соблюдение указанных основных правил постановки опыта прн определении биологической активности антибиотиков методом диффузии в агар позволяет получить вполне сравнимые результаты. Среди диффузионных методов определения биологической активности наиболее широкое применение нашли три метода, рассматриваемые ниже.
Метод с использованием металлических 1(илиндриков. На поверхность питательного агара в чашках Петри нлп в спецкальньж кюветах расставляют металлические цилиндрики (с внешним диаметром 8 мм, внутренним диаметром 6 мм н высотой 10 мм) пз алюминия нли нержавеющей стали. Как правило, пнтательнып агар используют двухслойный: 1-й слой агара наливают из расчета 15 мл на одну чашку Петри (диаметр 9 см); 2-0 слой агара, содержащий определенной плотности суспензпю тест-организма, разливают на застывшую поверхность первого слоя агара по 5 мл Рис.
23. Определение бножяической активности антибиотиков диффузная. ным методом с использованием металлических иилиидриков Рис. 24. Приспособление для получения лунок в толще атаровой пластин- ки на чашку. На застывшую поверхность второго слоя агара по специальному трафарету расставляют предварительно простернлнзованные металлические цилиндрики (5 — 6 цилиндриков на чашку)'. В одни цилиндрики вносят испытуемый раствор антибиотика, в другие — стандартный раствор того же антибиотика с известным числом мкг или единиц активности в 1 мл раствора. Обычно цилиндрики с испытуемым и стандартным растворами чередуют. Затем чашки пли кюветы помещают в термастат прн температуре, оптимальной для роста тест-организма на 20 — 24 ч, после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-микроба (рнс. 23).
Расчет количества антибиотика в 1 мл раствора ведут илн по стандартной кривой, полученной на полулогарифмпческой сетке, плн по таблицам Дмитриевой (1958). Метод с лрнненением лунок в толще изара. В толще агаровой пластинки делают лунки диаметром 8 мм. используя чробочное сверло соответствующего диаметра нли специально сделанное приспособление, состоящее пз резиновой груши, в которую вставляют заостренную с одного конца металлическую трубочку с внешним диаметром 8 мм (рнс. 24).
Блочки, надрезанные пробочным сверлом на всю глубину агаровой пластинки, удаляют с помощью стерильного скальпеля или специального крючка. В один лунки вносят раствор испытуемого антибиотика, а в другие— стандартный раствор антибиотика (рис. 25). Метод лунок имеет некоторые преимущества по сравнению с первым методом (нет необходимости в очистке и стерилизации цилиндриков). При использовании шалнндряиов, сделанных из алюминия.
иногда может происходить взаимодействие кислых антибиотиков с металлом, что приводит к частичной или полной Рнс. 25. Опрелелеаве антнбнотаческой актнвнпстн препаратов в кюветах с нсппльзоааниен лунок а толще агапа икактивации препарата. При работе с лунками это полностью исключено. При работе с цилиндркками возможно (особенно у начинающих исследователей) подтекание раствора аитибиотвка из-под неправильно поставленных цилиндриков, что приводит к образованию расплывчатых зон неправильной формы. Метод лунок не дает подобных эффектов, Метод использования дисков фильгровальной бумаги.
На поверхность питательного агара, засеянного тест-организмом, помещают диски фильтровальпой бумагя, пропвтаниые испытуемым раствором антибиотика. В качестве стандарта используют диски, смоченные раствором антибиотика известной концентрации, или специально приготовленные двскв, содержащве уже кзвестпое количество антибиотиков.
Дальнейшие операции проводят так же, как и при работе с применением лунок в толще агара. В некоторых случаях при использоваввн бумажных дисков получаются зоны неправильной формы. Это связано с тем, что в данном случае диск фильтровальяой бумага оказывается хроматограммой изучаемого антибиотика и препарат концентрируется в одном участке диска. Турбидиметрические методы. Широкое распространение в практике количественного определения аптибиотнков нашли турбидимегрические методы, в основу которых положена логарнфмическан зависимость степени угнетения роста тест-организма от концентрации аятибиотяка. Метод основан яа измерении копцептрации клеток тест-микроба, образующих определенную оптиче- 161 скую плотность среды (мутность) в результате роста в присутствии небольших количеств антибиотика.
В присутствии небольших количеств антибиотика не происходит полного подавления роста тест-микроба, а лишь задержка темпа их роста, что н сказывается на оптической плотности бульона. Турбиднметрнческие методы определения антибяотнков обычно неприемлемы для плотно окрашенных растворов. Но, учитывая высокую чувствительность этих методов, применяются довольно большие разведения исследуемых жидкостей, что приводит к значительному снижению концентрации пигментных веществ, мешающих проведению анализа; в ряде случаев можно использовать турбидиметрнческий метод н для окрашенных растворов, Оптическую плотность жидкостей определяют с помощью фотоэлектрокалориметра (гРЭК) или обычного турбиднметра, Этн методы пригодны для количественного определения любых антибиотиков при условии наличия стандартного раствора изучаемого препарата.
При подборе быстрорастущих организмов, используемых в качестве тест-объектов, турбндиметряческий метод можно использовать как экспресс-метод †отв получают через 3,5 — 4 ч. ХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Химические н физико-химические методы определения различных групп антибиотиков все шире и шире используются в лабораторной практике Их преимущество по сравнению с биологическими методами состоит в быстром проведении анализов и, следовательно„в быстром получении ответа. В ряде случаев химические и физико-химические методы несколько уступают по точности биологическим методам.
Однако их основное свойство — высокая скорость определения — способствует широкому практическому использованию. К химическим и физико-химическим методам относят колорнметрические н спектрофотометрические методы, основанные на образовании различных соединений или использовании определенных свойств антибиотиков: цветные реакции, исчезновение характерных полос в ультрафиолетовой или инфракрасной частях спектра под действием различных веществ (кислот, щелочей н др.). Чисто химические методы определении количества антибиотиков применяются очень редко. Описано несколько модификаций определения пенициллинов, в основу которых положено поглощение иода продуктамн гидролиза этого вещества.
Определение пенициллина можно также производить ацидометрическим способом. Прн расщеплении молекулы пенициллина с помощью пенициллннацилазы или щелочи с образованием пеннциллановой кислоты происходит освобождение одной карбоксильной группы, которую можно учесть тнтровапием. Чаще применяют колорнметрические и спектрофотометрпческие методы определения концентрации антибиотиков. В основу ,колорвметрических методов положен принцип превращения препарата или его отдельных группировок в окрашенные соединения.
Спектрофотометрические методы основаны на свойстве многих антибиотиков давать характерный спектр поглощения в видимом свете илн в ультрафиолетовой области. Определение стрептомицина основано на характерных реакциях различных функциональных групп молекулы антибиотика. Чаще всего применяется мальтольный метод, который состоит в том, что при щелочном гндролизе стрептомицнна из стрептозной части молекулы образуется мальтол, который с солями трехвалентного мальтск железа дает окрашенное соединение. Этим методом можно определять стрептомицин в растворах товарных препаратов и в культуральных жидкостях после соответствующей их очистки.
Лля получения вполне воспроизводимых результатов прн работе указанным методом рекомендуется использовать следующую методику к 10 мл стрептомицина (концентрацня 100 — 300 мкг/мл) добавить 2 мл 0,2 н. едкого патра, опустить сосуд в кипящую водяную баню на 4 мин, затем охладить в водопроводной воде в течение 3 мин, добавить 8 мл 1$-ного раствора железоаммиачных квасцов в 0,55 н. серной кислоте и точно через 3 мин после этого измерить удельную экстинкцию (оптическую плотность, или поглощение).
Для определения маниозидосгрептомнцина, который обычно образуется в определенном количестве вместе со стрептомицином, применяют антрон — вещество, обладающее способностью давать с углеводами в крепких растворах серной кислоты соединение интенсивно зеленого цвета. Определение оптической плотности этого окрашенного соединения обычно проводят на фотоэлектроколориметре. Определение тетрацлклиновых антибиотиков физико-химическими методами также основано на образовании окрашиваемых соединений при взаимодействии этих антибиотиков с хлористым железом, солями меди, азотной нли серной кислотами. Тетрациклиновые антибиотики количественно могут определяться спектрофотометрнческим методом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
