Егоров - Основы учения об антибиотиках - 1986 (947288), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Непременное условие — бульон должен быть прозрачным. Одновременно с этим подготавливают п культуру тест-организма. Стерильный питательный оульон разливают в чистые стерильные пробирки; количество бульона должно обеспечивать нужную степень разведения изучаемого антибиотика. В тех случаях, когда антибиотик обладает высокой биологической активностью и в испытуемом растворе содержится в большом количестве, необходимо подготовить ряд пробирок с пвтательным бульоном таким образом, чтобы обеспечивалось получение относительно большого разведения. Например, в две пробирки вносят по 9 мл бульона в каждую.
В первую пробирку вносят 1 мл испытуемого раствора антибиотика (разведение 1: 10), тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят во вторую пробирку (разведение 1 ". 100). Затем 1 мл раствора разведения 1: 100 смешивают с 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 мл бульона — получают разведения 1: 200, 1: 300, 1: 400, 1: 500, 1:600; 1: 700 и 1:800. Для дальнейшего увеличения разведения испытуемого антибиотика, последовательно отличающегося на 100, берут 0,5 мл раствора с разведением 1: !00, смешивают с 4; 4,5; 5 и 5,5 мл бульона н получают разведения 1: 900; 1: 1000; 1: 1100 н 1: 1200.
Прп желании мо кно данный ряд разведения увеличить до необходимого значения. Иногда используют и другие ряды разведенпГЕ например 1: 1О, 1: 20, 1: 40, 1; 80, 1: 160 и т. д. или 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1: ! 6; 1: 32 н т. д. В полученном ряду разведений антибиотнческого вещества в ствующем б-й пробирке. Следовательно, Б миг/мл вызвали бы подавление роста микроба только в 4-й пробирке, но не в б-й, а 20 мкг/мл задержат рост в 6-й пробирке, 40 мкг/мл — в 7-й; 60 мкг/мл — в 8-й; !60 мкг/мл — в 9-й; 320 мкг/мл — в 10-й пробирке и т. д. Сравнивая эти величины, устанавливают, что испытуемый раствор, задерживающий развитие тест-организма в 10-й пробирке (разведение 1: 1024), содержит 320 мкг/мл стрептомицина. Расчет антибиотической активности испытуемого раствора прп работе по методу последовательных разведений при наличии стандарта можно производить по следующей формуле: Х = Рп: Рс - С, где Ри — максимальная степень разведения испытуемого раствора, при которой отсутствует рост тест-организма; Рс — макснмальпая степень разведении стандартного раствора, обеспечиваницая отсутствие роста тест-микроба; С вЂ” исходная концентрация стандартного раствора антибиотика; Х вЂ” искомая концентрация антибиотика н исследуемом растворе.
В нашем примере Рн=1024; Рс=32; С=10 мкг/мл; искомая концентрации антибиотика Х = 1024: 32 ° 10 = 320 мкг/мл. Метод последовательных разведений может дать сопоставимые результаты лишь при соблюденнк определенных условкй, а именно: 1. Тщательная стерильность проведения анализов. 2. Использование постоянных сред для разведения одного итою же антибиотика. 3. Внесение определенного количества клеток нли спор тест-организма.
4. Определенная длительность пикубацин пробирок, засеянных тест-культурой. 'Иногда под действием испытуемого антибиотика возникают устойчивые к нему формы тест-микроба. Появление даже единичных резистентных клеток, которые могут дать затем развитие, приведет к ошибочным результатам прп определении бпологическойактнвностп препарата.
Чтобы избежать подооного явления, для разведешгй используют не бульон, а агаризованные среды, разлитые в пробирки. После проведения процесса разведения пробирки размещают в наклонном положении, с тем чтобы получить косички застывшего агара. На поверхность скошенного згара микробиологической петлей высевают суспензию тест-микроба. После этого пробирки помещают в термостат на 24 ч прн температуре, оптимальной для развития тест-организма. Расчет активности ведут тем же способом, что н при разведении антибиотика (культуральной жидкости) в жидкой среде. Появление одиночных колоний, образовавшихся иэ резистентных форм, в расчет ие принимается. Определение аитибиотической активности методом серийных разведений можно производить и на чашках Петри.
В пробирки, содержащие по 9 мл расплавленного питательного агара, вносят по 1 мл определенного разведения изучаемого антибиотика илп культуральной жидкости. После тщательного перемешивания содержимое пробирки выливают в чашку Петри н дают агару застыть. Затем по поверхности пластинки штрихами производят посев тест- организмов. Чашки выдерживают в тсрмостате при оптимальной для используемых тест-организмов температуре в течение 20 — 21ч. Преимущество этого метода по 'сравненшо с пробирочным методом разведения состоит в том, что в данном случае каждое разведение изучаемого препарата может быть использовано для многих тест-организмов. Диффузионные методы.
Количественное определение антибиотиков диффузионными методамн основана на способности антибиотических веществ диффундпровать в агаровых средах н образовывать зоны, в которых не развиваются используемые тест-организмы. Величина зоны диффузяи антибиотика зависит прежде всего от химической природы антибиатического вещества и его концентрации, состава агаровой среды, ее рН, температуры и других факторов, которые необходимо учитывать прн проведении анализов.
Антибиотики-полипептнды, обладающие большой и сложной молекулой, диффундируют гораздо медленнее, чем, например, антибиотики ациклического строения плн антибиотики тетрацнклиновой природы и гетероциклическаго строения. Поэтому для количественного определения антибиотиков, трудно дкффундирующих в агарнзованных средах, необходимо подбирать условия, обеспечивающие лучшую их диффузию. К таким условиям можно, например, отнести добавление к среде отдельных веществ, повышающих ,диффузию антибиотиков. Так, СаС!, способствует повышению диффузии грамицидина С.
Иногда чашки с агарам, тест-культурой и антибиотиком помещают на 20 — 24 ч в холодильнпк (+4'); тест-' оргзиизм в зто время не развивается, а антибиотик днффундирует. Используя этот метод, можно примерно в два раза увеличить скорость диффузии антибиотика прп нормальном периоде роста тест-организма. Концентрации испытуемых антибиотиков ие должны быть слишком высокими, так как установлено, что диаметр зоны задержки роста тест-организма есть линейная функция логарифмов концентрации антибиотика, но лишь в определенных пределах концентрации.
Так, увеличение концентрации неомицина выше 5$> по существу не сказывается на величине зоны задержки роста тест-микроба. Величина зоны задержки роста тест-организма зависит в определенной степени от длительности контакта антибиотика со средой (табл. 39). Анализы необходимо проводить через определенный интервал времеви, так как между моментом посева тест-организма и нача.
лом его прорастания проходит какой-то промежуток времени, и 157 г абагча 62 Педычнна пом угнетении роста оггерйюиреею агптоуасуеаа в аавмсныостн от времена момтамта аитибмотмаа (на буыааа!ом амсее с агароы) (но Тен1ои, 1%3, 19бха) Исписана аеиы угнетении роста. ын Исписана эыы угистыиы раста, мы дни!ель!исти еоиыита Оу. ° ми!ного Имена с а!аром пй ед посевом антгыоницста длигелыыыь ко!паню В го!и ного Л!ыап с егерем перед посеном аигино- мицега иычынты!ынол, нниинынные ристнор ьлирамаы!ни!еы!ыа риса!игр сгрноинслма стрсстомнции, е еь' серноинслыа сцэсг1ъоьы ыиг, е.е% 1 ынн 20 ыин 2 ч гг бч 24 ч 1з.о 1З,О 12,5 1Ь,О 1т,о л ХмриаарФщиамн о Хмраыеыыыот и анаинирмгагагл гр греты )ГЮ бс 6Д а» 65 66 1 2 З 6 5», Гд!ааг 67 62 й» 45 66 т рл Рис. 22.
Зависимость биологнчесиой аитнвности антнбиотаюв от со- става среды и ее рН течение которого антибиотик продолжает диффунднронэть в агар и оказывать биологическое действие. Состав агароаой среды и ее рН также существенно влияют на величину образовании зои задеря'кп и рост тест-микроба (рнс. 22). Стрептомицнн, стрептотрпцпн, неомицнн проявляют антибиотическне свойства более сильно в щелочной среде (рН 7„5 — 8,0); тетрацпклиновые антибиотики наиболее активны в слабонпслой зоне (рН среды 6,3 — 6,4).
Наличие в среде ароматических аминокислот снимает биологическую активность антибиотика азасервяа по отношению к Е. соК Плотность используемой культуры тест-организма должна быть постоннной для каждой серии опытов, нбо с повышением плотности клеток тест-кучьтуры уменьшается величина зоны задержки ее роста, так как бактерии заметно влияют па процесс диффузии антибиотика ввиду того, что антпбнотические вещества в опреде« ленной мере связываются этими организмами. Применение в опытах постоянной плотности вегетатнвных микробных клеток п спор тест-организма в агаровой среде дает воз- можность попучать зоны угнетения роста используемой тест-культуры соответствующей величины с резко очерченными краями. Чаще всего длв определения плотности микробных клеток и спор бактерий используют фотоэлектрокзлорпметр илн стеклянный оптический стандарт, выпускаемый Государственным контрольным институтом нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
