Егоров - Основы учения об антибиотиках - 1986 (947288), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Различие лишь в некотором удлинении срока наблюдения (до 12 лией). В опыте с клетками асцитного рака Эрлиха наблюдение ведут в течение 10 дней. Чашечиый метод. Разработан чашечный метод определенпядейетвия изучаемых антибпотпческпх препаратов на раковые клетки. Тест-обьектом служат клетки асцптиого рака, которые сь(ешиваются с теплой агаровой средой (пелтон, глюкоза, плазма крови) я разливаются в чашки Петри. На застывшую агаровую пластинку, содержащую клетки асцптного рака, накладывают агаровые Кол«Чеетво «лвпа в ! мл ввв«св. «еовволввое ллл вооечз«овле«ня мог«лево«ого сваей Сарковш Крекера у мышей То же Опухоль ОЖ-5 у мышей Саркома М-! у крыс ео же Рлк молочной железы у человека Саркома голени у челгвека 1 000 000 — ! !00 000 350 000 — 400 000 ! 000 000 — 1 1ОО 000 5 000 000 — 5 500 ООО 1 000 000 — 1 500 000 ! 500 000 — 2 000 000 1 500 000 — 2 000 000 4 24 24 24 72 45 72 П р в м е ч в в в е.
длв вс««шм«рв«овмч «легок — т- ге' в ! вл. Приведенные данные показывают, что, пользуясь чашечпым методом, вполне возможно вести отбор противораковых веществ 151 блочки с выросшей культурой мпкроорганиэма илп диски фильтровальиой бумаги„предварительно смоченные культуральной жидкостью нли раствором очищенного препарата. Чашки помещают в холодильник на несколько часов для диффузии изучаемых веществ в толщу агара, содержащего асцитные раковые клетки (2 !О' клеток в 1 мл1. После этого чашки помешают в термостат при ЗTС на несколько часов и затем, вынув нх из термостата, освобождают от агаровых блочков или дисков фпльтровальной бумаги.
Поверхность агэровых пластинок заливают 0,05Ъ-иым раствором метиленового синего Чашки покрывают стеклянными пластинками иснова помещают в термостат на несколько часов. Прн отсутствии действия антибиотика на раковые клетки асцитного рака вся поверхность агаровой пластинки будет бесцветной.
Если же изучаемые препараты убивают клетки зенитного рака, то на месте агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги появятся голубые зоны. Свойство обесцвечивать метиленовый синий, т. е. превращать его в лейкосоедннение. связано с выделением живыми асцитными клетками ферментов дегндраз. Убитые клетки ие выделяют дегидраэы и метиловый синий не обесцвечивается. Следует отметить, что дегидразная активность раковых клеток может обнаруживаться не только с помощью метиленового синего, но и с помощью ряда других веществ, например х,б-дихлорфенолнндофеиола, солей тетраэола. Способностью восстанавливать метиленовый синий обладают взвеси клеток различных опухолей животных и человека.
Однако в случае использования взвеси клеток солидных опухолей их количество в 1 мл взвеси, необходимое для восстановления метилеиового синего, различно (табл. 371. Таблица 57 Колнчество клеток разлнчных солнлных опухвлей макетных н человека, необхолнмгм ллн восстановленнн метнленового синего (по Талызнной, 1900) на раковых клетках человека, так как взвеси последних, как н, клетки асцптпого рака, восстанавливают метилеиовый синий. Препараты, подавляющие пли тормозящие рост опухоли, обычно подавляют и дегидразную активность соответствующей опухоли.
Пробирочиый метод. В качестве определенной модифпкацничашечного метода является метод испытания противораковой активности антибиотиков в пробирках. Метод состоит в следующем. В стандартные пробирки вносят 0,5 мл испытуемой культуральиой жидкости и 0,5 мл взвеси клеток асцптного рака Эрлиха (конечная концентрация клеток 500 тыс/мл), затем добавляют 2 мл расплавленной агаровой среды, содержащей метиленовый синий. В контрольные пробирки вместо испытуемой культуральной жидкости добавляют 0,5 мл среды, на которой выращивается изучаемый организм.
После перемешпвания яробнркн помещают на 3— 4 ч в термостат при 36 — 37'С. Если содержимое пробирок окрашивается метилеиовым синим, то зто указывает на то, что испытуемый препарат подавляет дегидраэную активность клеток асцитного рака. Преимущество пробпрочного метода по сравнению с чашечным в том, что при этом происходит непосредственный контакт антибиотика с асцитиыми клетками Эрлиха независимо от степенидпффузин изучаемого препарата в агар.
Использование мияраоргаиизмов при изыскании противораковых антибиотиков. Обмен веществ в опухолевых клетках отличается от обмена нормальных клеток; различие, в частности, определяетсл интенсивностью дыхания; в опухолевых клетках оно значительно снижено. Исходя иэ этого, высказано предположение о возможности использования мутантов микроорганизмов, имеющих пониженный коэффициент дыхания, в качестве тест. объектов для поисков иротпвораковьж антибиотиков. В результате ультрафиолетового облучения и действия уретана удалось получить мутанты стафплококков, бактерий кишечной группы и других организмов с пониженным коэффициентом окисления. Поглощение кислорода у таких микроорганизмов может составлять 20 — 80Ъ по сравнению с дыханием исходных родительских культур.
В качестве тест-организмов для определения антиопухолевого действия культуральных жидкостей микроорганизмов можно также применять мутанты дрожжевых организмов с пониженным коэффициентом дыхания. Сравнивая чувствительность метода с использованием асцитных клеток Эрлиха и метода с биохимическими мутантами микроорганизмов, следует заключить, что биохимические мутанты— более чувствительные тесты при определении противоопухолевого деиствия микроорганизмов. Использование опухолевых клеток, выращенных 1п т11го, для отбора организмов, образующих противоопухолевые антибиотики. В последнее время оказалось возможным культивировать некоторые опухолевые клетки в искусственных условиях (1п т)1го) подоб- но тому, как это осуществляется в отношения микрооргайязмов.
Лейкемнческие клетки мышей могут расти и размножаться в среде, содержащей пептон, диалнзированную лошадиную сыворотку и фолиевую кислоту (10 мкг(мл~. Это позволяет использовать перевнваемые штампы клеток рака человека для изучения протизоопухолевого действия некоторыхантибиотиков. С этой целью клетки перевиваемых штаммов выращивают в матрацах Ру на специальной среде с добавлением 10"м телячьей сыворотки. Культивирование проводят при 36'С. Через 6— 7 суток среду удаляют и слой клеток снимают с поверхности стекла 0,02%-ным раствором этилепднамннтетрауксусной кислоты.
Через !5 — 20 мин пикубацяи н термостате клетки переходят в суспензню. Способность некоторых опухолевых клеток размножаться в пробирках позволяет применять нх в качестве тест-объекта при поиске, выделении и очистке новых антнбнотическнх веществ, обладающих противоопухолевой активностью. С этой целью можно использовать опухолевые клетки лпмфолимы. Для получения асцита клеток лнмфолпмы белым мышам вводят виутрибрюшннно по 0.3 мл взвеси асцитных клеток.
Через 10 — 12 дней асцит стернлюю отбирается и сразу же вносится в про. бирки с вышеназванной средой для выращивания клеток в пробирках. Количество среды в каждой пробирке равняется 2 мл. Оптимальная концентрация опухолевых клеток составляет 3 10з— 5 10з в 1 мл среды. При этих условиях через 48 ч инкубации при 36,5'С в пробирках без перемешпвапня происходит увеличение числа клеток и 1,5 — 2 раза. Размножение клеток в культуре учитывается подсчетом в камере Горяево. Если исследуемый препарат тормозит развитие н размножение клеток асцнта, то это указывает на его антнопухолевое действие.
Применение этого метода позволяет производить первичный отбор протпвоопухолевых антибиотиков на стадии культуральной жидкости, осуществлять выделение н химическую очистку отобранных антибиотиков. Причем удается обнаружить и выделить протпвоопухолезые антибиотики, не обладающие подавляющям дейстанем в отношении обычных тест-организмов, биохямпческогомутанта стафплококка и не действующие на дегидразную активность опухолевых клеток лимфолнмы.
й4ЕТОДЬ1 КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ Количественное определение антпбпотнкон в культуральных жидкостях, готовых препаратах или в разнообразных растворах осуществляют различными методами: биологическими, химическими н физико-химическими. Наиболее распространены биологические методы; они не требуют специального дорогостоящего оборудования и дают довольно точные результаты. БИОЛОГИЧЕСКИЕ !ПЕТОЛЫ Биологические методы количественного определения антибиотиков нашли широкое применение на практике. Они основаны на непосредственном биологическом действии антибиотика на используемый тест-организм, чувствительный к данному препарату, апоэтому считаются напоолее объективными.
Омелянскпй еще в 1906 г. указывал на преимущества биологических методов прн количественном учете разных веществ. Онписал: «В липе бактерий химия приобретает новый и поистине неисчерпаемый источник разнообразнейших реактивов, во много раз более точных и более спепиалязнрованиых, чем те, какими располагала эта наука до сих пор». Однако биологические методы определения антибиотиков имеют и недостатки: длительность проведения анализов, зависимость точности результатов от многих внешних факторов и т. п. Точность бпологическпх методов обычно составляет -~ 10%.
Наиболее широкое распространение среди биологических методов количественного определения антибиотиков получили метод последовательных разведений, диффузионный п турбядиметрическнй методы. Метод последовательных разведений. Метод используется для определения количества антибиотика в культуральных жидкостях, растворах нлп в экстрактах. Для работы подготавливают питательный бульон, пригодный для развития выбранного тест-организма.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
