Егоров - Основы учения об антибиотиках - 1986 (947288), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Обычно для экстракцип антибиотика из клеток продуцента применяют органические растворителя (этиловый спирт, подкисленный этиловый спирт, ацетон п другие вещества). Для оценки антибпотическпх свайств микроорганизмов, выросших в жидких средах, можно испбльзовать метод последовательных разведений (с. 154) н метод бумажных дисков.
Метод бумажных дисков. На агаровую пластинку в чашке Петри высевают соответстауюшпй тест-организм. Затем чашки с засеянным тест-микробом подсушявают в термостате при 37'С в течение 15 — 20 мин. На одной чашке, т. е. в отношении одного тест-организма, может быть испытано одновременно 6 — 7. культуральных жидкостей. Диски из фильтровальнай бумаги диаметром 8 мм заготавливают впрок, стерилвзуют в автоклаве под давлением выше цормальнога на одну атмосферу в течение 20 — 30 мнн. Стерильный диск фнльтровальной бумаги захватывают стерильным пинцетом н смачивают в испытуемой культуральиой жидкости, затем накладывают на поверхность питательного агара, засеянного тест-микробом.
Чашку с тест-организмом н бумажными дискамп помещают в термастат при температуре, аптнмальнойдля роста тест-организма, на 24 ч, если это бактериальные формьгтестмикроба, и на 48 — 72 ч для грибных илп дрожжеподобных форм. Прп наличии аптибиотического вещества в испытуемой культу- ральной жндности вокруг диска образуется зона задержки роста тест-микроба.
Приведенные методы пригодны для определения энтибвотической активности микроорганизмов только в отношении бактерий, актпномицетов, дрожжевых в дрожжеподобных организмов н грибов. Для выиснення антивирусного плп антпопухолевого действия организмов в силу специфичности этих объектов используют другие методы. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ Вирусы — внутрпклетачные паразиты н поэтому не могут развиваться в виде «чистой культуры» вне клеток своего хозяина. Это обстоятельство н заставляет применять другие методы первоначального отбора активных веществ, отвечающие особенностям развития вирусов. Метод ткаиевых культур. Сушествует несколько вариантов метода тканевых культур, но наиболее удобен метод использования переживавших кусочков хорионаллантансной ткани куриного эмбриона в модификации Тима, Фалкерса и Харсфолла (1953).
Из верхней части куриного яйца с 10 — 11-дневным эмбрионом вырезают стерильными ножницами шесть кусочков скорлупы с 147 прилегающей к ней тканью хорионаллантонсной оболочки. Кусочки ткани осторожно отделяют от скорлупы н промывают буферным раствором. Каждый такой кусочек ткани помещают в пробирку с! мл среды следукидего состава (туа): Хат".!..... 0,68 МаНзРОв... 0.0!25 Кс! ..... 0,04 1ЧВНЮ„...
0,22 СаС1 .... 0,02 Глянт оса .... 1,0 МаА.... 0,0! Рнс. 2!. Использонаняе лястьеа дурмана лля онрелелення антнвнрусного леаетвня аятнпнотяков (но П!ораву н лр., !9861: т — очага некроза. вмзеанннс вврусом табачной мазанка, у — нзавчнс вротнаовнрусного нсаствнв, а отсутствие лействвв ва ннрусм !48 Кроме того, в каждую пробирку добавляют пенициллин ()00 ед/мл), с тем чтобы предохранить ткань от загрязнения (развития микроорганизмов). Пробирки устанавливают в специальный медленно (около 12 об/ч) вращающийся барабан. Для выяснения антивирусного действия продуктов жизнедеятельности определенного организма кусочки ткани заражают соответствующим видом вирусов и вносят в пробирка, содержащие культуральную жидкость (при РН 7,0) исследуемого организма.
Пробирки помещают в барабан на 48 ч. Если культуральная жидкость обладает антивирусным действием, то в среде, окружающей ткань, не будет обнаружено вируса. При отсутствии антивирусного действия вирусы будут интенсивно размножаться в клетках ткани, что может быть легко обнаружено методом титровання на эритроцнтах. Метод оценки антивирусных свойств культуральных жидкостей различных микроорганизмов прост, удобен и позволяет сравнительно быстро получить необходимый ответ при массовых у) ..:вл испытаниях.
Метод с использованием листьев рас;;ч":', гений. Разработан относительно простой метод выяснения антивирусного действия .члйнв'.*':. антибиотиков по отношению к вирусу тай . '~ ';: ',:,',-.'., бачиой мозаики. Микроорганизм выращивает и» агаро'*„':,',.": вой пластинке в чашке Петри. После достаточно хорошсга развития микроба из агара вырезают блочки, которые затем прикрепляют с помощью расплавленной желатины к листьям дурмана, предварительно зараженным вирусом габачной мозаики. Для предохранения от инфекции к желатине добавляют пенициллин. Листья дурмана с агаровымн блочками помещают на несколько дней во влажные камеры.
В течение этого периода поверхность листа дурмана покрывается очагами некроза. Но если находящееся в агаровом блочке антибиотнческое вещество, образуемое изучаемым организмом, подавляет развитие вируса, то вокруг такого блочки ие будет иекротнческих образований. Поверхность листа в зоне действия антибиотиков будет свободной от поражения вирусом табачпой мозаики (рис.21). Для окончательной оценки прот~вовирусиого действия аитибиотическнх црепаратоа необходимо использовать животных (чаще всего мышей) пли курииые эмбриоиы, заражеппые вирусами.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТИВОФАГОВОИ АКТИВНОСТИ Бактерио- и актииофаги обладают рядом свойств, общих с вирусами растений и животных. Фаги — это вирусы микроорганизмов. Определение протпвофаговой активности микроорганизмов осиоваио на тех же принципах, что и определение противобактериальных свойств организмов. Культуру, изучаемую на аитифаговые свойства, высевают иа вгаровую или в жидкую среду, благоприятную для образования антибиотического вещества.
В качестве тест-объекта используют смесь бактерий и специфического для этой бактерии фага. При пспользовапии одного из дпффуавоииых методов (метода агаровых блочков, лунок в толще агаровой пластинки, штрихов и т. д.) наблюдается следующая картина. Если знтибпотическое вещество подавляет рост фага, то в зоне диффузии аптибиотика будет происходить рост используемой балтерип, иа остальной жеповерхиости агаровой пластинки под действием развивающегося фага бактерии будут лизпрованы, и поверхность пластниьи останется чистой.
Если же под действием изучаемого биологически активного вещества ие произойдет развития бактерий и в зоне его диффузии, то это может означать, что используемый в опытах оргаипзм не образует противофагового вещества илп же образуемое антибпотическое вещество подавляет развитие как фага, так и бактерии. Последнее легко проверить, если в качестве тест-организма взять только бактерию. Протпвовируспым действием обладает ряд антибиотпческих веп1еств (эрлихии, лурпдпи, фумагнллпп, гениомиции, вирусии и др.).
ОПРГДГЛЕНИЕ ПРОТИВОРАКОВОГО ДЕЙСТВИЯ АИТИЬИОТИКОВ Не всегда антпракоаое действие препарата совпадает с антибактсриальным пли антпгрпбным действием. Поэтому для определения противораковой активности культуральпых жидкостей или очищенных препаратов в качестве тест-объектов используют иепосрсдствеиио раковые клетки. С этой целью применяют методы, основанные на использовании экспериментальных животных, культуры тканей или свободно плавающих в отдельных полостях организма опухолевых клеток (асцнтпые клетки), но окончательная 149 оценка аитиопухолевого действия испытуемого вещества проводится в опытах на кпвотных. Методы с использованием экспериментальных животных.
В качестве тест-объекта используются клетки асцптного рака Эрлиха у мышей (клетки находятся в виде взвеси в асцитпческой жидкости животных). Взвесь асцитных раковых клеток смешивается с равным объемом изучаемого антпбпотического препарата и смесь помещается в рефрюкератор прп 4'С иа четыре часа, после чего ее прививают мышам (подкожно). Для контрольных животных вместо исследуемого препарата используется физиологический раствор. Через 1О дней мышей убивают н определяют наличие опухолей и их размеры. Если изунаемый препарат убивает асшггные раковые клетки, то они, естественно, не дадут образования опухолей. Тест-объектом могут служить не только клетки асцитиого рака Эрлиха, но и других опухолей, полученных экспериментальным путем у мышей и крыс.
Использование клеток различных опудолей связано с необходимостью более широкого изучения противсюпухолевого действия исследуемых препаратов, для более точного определения значения изучаемой культуральной жидкости или антибиотика в отношении их действия на раковые клетки. Прежде чем использовать опухоль в качестве тест-материала, необходимо из опухолевых тканей получить тонкую взвесь.,С этой целью применяется следующий метод. В стерильных условиях вылущивают опухоль, тщательно очишают от некротическпх участков н несколько раз промывают стерильным физиологическим раствором.
После этого отобранные в чашки Петра кусочки опухоли измельчают ножницами до получения гомогенной кашицы и разводят примерно в 2 раза стерильным физиологическим раствором. После тщательного размешпвания взвесь фильтруют через 2 слоя стерильной марли. Затем определяют количество опухолевых частиц, содержащихся в 1 миз взвеси (подсчет проводят в камере Горяева).
Если прн подсчете оказывается, что количество частиц в 1 мм' незначительно, то полученную взвесь концентрируют методом центрпфугировайия. Надосадочную жидкость отсасывают, а опухолевые клетки, осевшие на дно пробирки, разводят нужным объемом стерильного физиологического раствора. В дальнейшем постановка опыта са взвесью опухолевых клеток, приготовленной пз опухоли животных, такая же, как и с клетками асиптного рака Эршгза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
