Егоров - Основы учения об антибиотиках - 1986 (947288), страница 33
Текст из файла (страница 33)
В основу этих методов положен нринцяп задержки развития микроорганизмов, принцип консервации. Для каждого вида продуцента антибнотических веществ должен быть подобран свой„наиболее подходящий метод консервирования, позволяющий сохранить культуры в активном состоянии в течение относительно длительного времени. Наиболее распространенными методами сохранения культур микроорганизмов-продуцентов антибиотиков в активном состоянии являются следующие. 1. Лиофилпзация культур. 2. Хранение вегетативных клеток или спор организмов в стерильной почве, стерильном песке нли на семенах некоторых растений (например, просе). По данным ряда авторов, культуры актииомицетов, находящихся в стерильной почве, сохраняют жизнеспособность в течение 30 лет н более. 3.
Хранение спор в виде водных суспензнй в запаянных ампулах. 4. Хранение спор в стерильном кварцевом песке. 5. Хранение культур на агаровом косячке под минеральным маслом. б. Хранение культур при низких температурах (+4, +5'С). Их 7, В последнее время для сохранения рвали пгых микроорганизмов в активном состоянии используют жидкий азот, в'который помещают отмытую от среды суспензяю клеток. Иногда в газообразной фазе н~идкого азота сохраняют культуры актииомнпетов, находящиеся на агаровых блочках, вырезанных нз агаровой пластинки в чашках Петри.
Наилучшей формой сохранения организмов, при которой не наблюдается потери аитибиотической активности, является их лвофилнзапия — метод пригоден как для спорообразующнх, так н для бесспоровых культур микроорганизмов Сущность этого метода состоит в том, что суспензия клеток илн спор микроорганизма, приготовленная на среде, богатой белками (часто используется для этих делей кровяная сыворотка), быстро заморажпваегся при температуре от — 40 до — 60'С н высушнвается под вакуумом до остаточной влажности (0,5 — 0,77ч).
После такой обработки ампулы со спорами плн клетками лпофилизированного микроба запаивают. Лиофплнзпрованные формы бактерий могут сохраняться в течение 16 — 18 лет, споры грибов не теряют основных свойств при хрвненип нх в лиофилизированном виде в течение !О лет. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ После того как микроб-антагонист выделен из естественного субстрата, его антибиотическую активность по отношению к различным тест-объектам определяют одним пз существующих методов. Прн определении антибпотических свойств микробов важно учитывать те факторы, которые влияют на образование антибиотиков (см.
гл. 1Ч). Изучение антпбиотпческпх свойств микроорганизмов осуществляют при культивировании их на твердых (агаризированных) илп в жидких средах. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫРОСШИХ НА ТВЕРДЫХ СРЕДАХ Большинство методов определения антнбпотпческой активности свизаио с культивированием изучаемого организма на агарпзнрованных средах. Здесь мы остановимся лишь иа наиболее распространенных методах выявления антибиотических свойств микробов. Метод перпендикулярных штрихов. Испытуемый организм высеваетсв штрихом (полоской) на поверхность агаровой пластинки чашки Петри. После того как микроорганизм разовьется, перпендикулярно его штриху подсеваются различные тест-организмы. Чашки помещаются в термостат иа 20 — 24 ч.
Если изучаемый организм оказывает антимикробное действие в отношении ряда тест- микробов, то последние будут расти вдали от штриха антагониста. Нечувствительные микробы будут развиваться в непосредственной близости от штриха изучаемого организма (рис.!6). !43 1тис. 16. Метод исрнеидикулнрных штриаов дли определении антагонистических свойств ыикроорганиаыов 144 Метод штриха широко используется в практике поиска продуцентоп аятнбиотпческпх веществ, однако он имеет один существенный недостаток. Прп методе тптрнха используется одна и та же среда для культивирования изучаемого организма н для раста тест-микробов. Например, если для образования антибиотика необходима среда с иитратным источником азата, то такая среда может быть совершенна непригодной для развитии ряда тест-организмов.
И наоборот, многне тест-организмы харашо растут на среде, состоящей из бульона Хоттингера (эта среда довольно часто применяется), но ие все организмы могут продуцировать антибиотик на этой среде. В этом случае можно не определить антибнотнческую активность организма, хотя он и обладает втой «посабностью. Метод агаравык блачквв. Изучаемый организм высевают сплошным сгазономв на поверхность агароной пластинки в чашке Петрп. Среда используется такая, которая благоприятна не только для роста организма, но, самое главное, для образования плс антибиотика. Иногда целесообразно высеиать организм па разные по составу среды.
После того как организм хорошо вырастет, пробочным сверлом ~диаметр примерно 8 мм) вырезают агаравые блочки, которые переносят иа поверхность другой агаровай пластинки, предварительно засеянной одним тест-организмом. На одну чашку Петри можно разместить б — 7 атаровых блочкав. Чашки с агаровыми блочкамп помешают в термастат на 20— 24 ч прп температуре, благоприятной для развития тест-организма. Если выделяемый организмом антибиотик подавляет развитие тестмнкраба, то вокруг агарового блочка образуется зона отсутствия роста. Чем больше выделяется антибиотика илп чем активнее образуемое антпбпатпческае вещество, тем больше будет диаметр эоны отсутствия раста тест-микроба 1рпс.
!7). Метод выссва антагониста иа одной половине атаровой пиастинки с последующим падсевом тест-микробов штрихами иа другой полввине агаровай пластинки. Чашка Петри разделяется стеклянной перегородкой пополам. В одну половину наливают витаэольный агар, благоприятный для развития изучаемого аргаиттзлта и вбразования антибиотика; другая половина чашки остается.сво- Рпс. 1У. Использоваппс агпрових блоч. ков с выросшей культурой ннкробв для внрехелепня сс вптнбнотнчссннх свойств Рпс. 18. Определенно автнбжяячо сках свойств ннкробпв, агяинхмрх пв возоввнр атаровой вврвчвнвя в чашке Пегов бодной. Иногда поступают иначе. В чашку Петри (без перегородки) налнвают питательный агар, затем, когда агар застынет, стерильным скальпелем удаляют одну половину агаровой пластинки.
На половину агаровой пластинки высевают сплошным «газономр изучаемый организм, и засеянные чашки помещают в термостат для получения хорошего развития' микроба. После зтого на оставшуюся свободную часть пластинки в чашке наливают расплавленный питательный агар, пригодный для развития тест-орга.- низмов, которые вырезают штрихамп, перпендикулярными границе развития антагониста. Чашки вновь помещают в термостат на 20 — 24 ч при температуре, благоприятной для развития тест-.организмов. Чувствительные тест-микробы будут расти на определенном расстоянии от ан- l тагониста, устойчивые же формы развиваются на протяжении всего штриха (рис. !8). у Метод агарового блочка, находящегося в центре чашки Петри.
Так же, как и в предыдущем методе, в чашке создаются благоприятные условия как для развя р Рнс. 19, Схема прпготовлптня антагониста, так и для развития тест пня чвшск 1!стон для опремикроба. деления аптпбнотнчсскнх В чашку Петри наливают питательный свойств мпррооргпннзнов, агар, пригодный для развития изучаемого внростпнк пз повсркностп организма с образованием аптпбнотичес- тпсгося в пептрс чашка (по кого вещества, пз расчета 20 — 25 мл на Егорову, 1збт): стандартную чашку. В застывшем агаре г — ртереемп одееее, з — егере.
еее среде, Сде~оернетнее дде стерильныч пробочиым сверлом (дна- раста тест-ертеппене 145 метр 20 — 22 мм) вырезают агаровые блочки, которые затем переносят в другие стерпльные чашки Петри. В центр каждой чашки помещают по одному такому блоку (рис. 1ЯЛ), затем в зтн же чашки на свободную нх часть наливают питательный агар, пригодный для развития тест-микробов, с тем расчетом, чтобы уровень этого агара был на 1 — 1,5 мм ниже уровня блачка (рис ! 9.2). В случае изучения бактериальных организмов приготовленные таким способом чашки необходимо немного подсушить, с тем рис. 20. Определение антнбнотвчессих чтобы удалить копденсацисвойств микроорганизмов методом онную влагу.
агарового бланка, находяшегося в После того как чашки центре чашки Петри !по Егорову, подготовлены, изучаемый ор!%71 гаппзм высевают микробиологической петлей иа поверхность агарового блочка, н чашки помещают в термостат на срок, обеспечивающий вормальпое развитие организма. Затем по радиусам агаровой пластппкп выссвают штрихами тест-организмы, и чашки вновь на 20 — 24 ч помещают в термостат. Отсутствие роста штриха тест-мнкроба на том или ином расстоянии от блочка будет указывать на угнетение его антибиотнческнм веществом изучаемого организма. Если же штрих тест-мпкроба развивается в непосредственной близости от агарового блочка, то это означает, что данный организм устойчив к действию антибиотика изучаемого антагониста (рис.
20). Для изучения актпномпцетов рационально агаровые блочки того же дпаметра вырезать пз среды„ на которой уже вырос актиномпцет. Посев тест-микробов производят сразу же после внесения атаровой среды в чашку нли же чашку предварительно помещают на 18 — 20 ч в термостат при 20 — 30'С, с тем чтобы накопившийся в блочке антибиотик лучше продиффундировал в окружающий агар. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ их В жидких питАтельных сРедАА Прп определенна антибиотическнх свойств микроорганизмов, культивируемых в жидких средах, необходимо иметь в виду, что некоторые антибиотика в процессе развития микробов накаплива- 146 ются внутри клеток продуцента, практически ие выделяясь в окружавшую среду, Поэтому определение антибпатических свойств Организмов следует проводить как в культуральной жидкости,тэи и в экстрактах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
