Егоров - Основы учения об антибиотиках - 1986 (947288), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Выделение новых форм микроорганизмов позволяет надеяться на получение новых аитнбнотическпх веществ с цениыл»п свойствамп. Микроскопические грибы предпочтительнее развиваются на средах с несколько пониженным значением рН (4,5 — 5), на которых плохо растут многие бактсрии и актпномпцеты. Выделение грибов можно производить как па сии '(например, среда Чапека), так п иа сложных по составу натуральных средах (например, сусло-агар) с начальным рН=4,5 — 5. Для выделения микроскопических грибов-продуцентов антибиотиков можно рекомендовать слсдуюпшс среды.
)?ерзая среда (в пропеитах): глюкоза — 2; сахароза — 2; 14Н»ЫО» — 0,02; КзНРΠ— 0,1; кукурузный экстрак~ (сухое вещество) — О,1; Мц5О» 7ͻΠ— 0,05; Еп50» — 0,01; Ре50» — 0,001. Вторая среда (в процентах): глюкоза — 1, сахароза — 1; перевар Хоттингера (объемные проценты) — 4; К,НР΄— 0,05; Мд5О» 7ͻΠ— 0,05; Хп50» — 0,001; Ре5О» — 0,001. Среды, пригодные для выделения микроорганизмов, не всегда благоприятны для образования нми аитпбпотнческих веществ.
Так, многие актниомицеты хорошо растут на простых синтетических средах, но не все штампы сннтезпруют на этих средах аптибиоти- ческпе вещества Иногда для образования антибиотика необходимо организм культивировать на натуральных средах, таких, как ' бульон Хотти»гера, картофельный! отвар и т. п. Аналогичное явлен!ае может нметь место и в отношении некоторых видов бактерий и плесневых грибов. Например, для выяснения антнбнотпческого действия актнномнцетов рекомендуется среда следующего состава: Соеаая мука ......... !О г Глюкоза ........... !О г ИаС! . . .
. . . . . . . ... 5 г СаГО„............ ! г Вода........... !ООО мл рН такой среды следует поздеригпвать иа уровне 6,8. Прп выделении продуцентов новых антибиотиков для культ!ы внровапия мнкраарганпзмов следует шире применять разлнгиые селективиые среды, в том числе и среды, содержащие антибиотики. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКРОБОВ-ИРОДУЦЕНТОВ АНТНБИОТИКОВ Высев почвенной взвеси в воде на поверхность атаровой пластн»кн. Определенная навеска почвы. тщательно растертая в стуцке с небольшим объемом воды, колнчественнопереноснтсявколбу са стерильной водой. Салери'имое колбы встряхивается в течение 6 мпн, а затем пз вахнай суспензия делается ряд последовательных разведений, которые высеваются на соответствующую агарнзнраванную среду. Для получения в дальнейшем чистик культур отдельные колонии после инкубацни в термостате при нужной температуре пересеваются и пробирки со скошенным пптатечьпым агарам.
Каждан чистая культура микроорганизма пересевается на различные по составу среды и после достаточно хорошего развития проверяются ее аитибпотические свойства. Высев почвы на питательный агар, предварительно засеянный тест-организмом. Поверхность питательного агара засевается тесткультуроп необходкмого организма, после чего на агаровую пластинку рас!кчадывают небольшие, не более просяного зерна, комочки почвы пли же почву наносят в виде пыли, распределяя ее по всей поверхности пластинки.
Затем чашки помещают в термастат п через определенпыя промежуток времени !24 — 48 ч. а иногда и более! просматривают кусочки почвы нлн отдельные ее участки, вокруг которых образовались зоны задержки роста тест-организма. Из этих участков выделяют чистые культуры организмов и подвергают нх дальнейшему изучению. Метод можно модифицировать. На чашки Петри с мясопептонным агаром, предварительна засеянным тест-организмом, микробиологической петлей наносят отдельнымн каплями взвесь почвы. На каждую чапцау наносят !6 — 20 капель, которые, подсыхая, оставляют после себя изолированные комочки почвы. Через 1 — 2суток нахождения чашек в термостате прп 26 — 35'С комочки почвы !2! обрастают ьолонкямн, вокруг некоторых из ннх обнаружнваются воны задержки роста тест-органнзма, Комочки, окруженные зонамп, рассевают на свежие чашки с агаром и после того, как вырастут отдельные колоиин, нх отвивают для получения чистых культур, которые подвергают дальнейшему исследованию.
Метод обогащения почвы. Почву, из которой предполагают выделить антагонистов, обогащают органнзмамн тех вндов, по отношению к которым хохлят получить антагонист. С этой целью к образцам почвы, помещенным в стеклянные сосуды, снстематнческп добавляют отмытую суспснзню нужных микроорганизмов. Затем через определенные промежутки времени такая почва высевается в виде отдельных комочков на агаровые пластинки в чашках Петри, предварительно засеянные тем же самым организмом, который использовался для обогащения почвы. Метод центрнфугирования почвенной суспензия. Для вылеленпя актиномицетов нз почв н особенно из почв в весеннее время, когда в ней развивается большое числа грнбов и бактерий.
прнмеияется метод центрнфугирования почвенной взвеси. Метод основан на различая скорости оседания отдельных видов микроорганизмов в центробежном поле. Пря 3000 об/мин в течение 20 мян частицы, соответствующие по размерам спорам плесеней илн кле~кам бактернй тяпа Вас. тезеп1епсиз, Вас. тйсоЫез, Вас. зиЬ/11/з, осаждаются на дно пробирки. Частицы же, соответствующие по размерам спорам актняомнцетов, оказываются при данной скорости цснтрнфугировання в поверхностном слое жидкости.
Высевая надосадочную жидкость, удается в большинстве случаев Гдо 92%) получить на пластннках питательного агара толька.колоннн актиномнцетов. Метод заморажнвания — оттаивания почвы. Известно, что микроорганизмы в почве находятся в адсорбнрованиом па почвенных частицах состоянии. Для полноты десорбпин мнкроорганнзмов с почвенных частиц применяются разлячные методы: хнмнческке, прн которых почвенные образцы обрабатывают разлнчнымн детергентами, физическне, в основе которых лежнт метод механического растнраняя образцов почвы.
Для лучшей десорбции мнкроорганнзмов с почвенных частиц рекомендуется использовать метод заморажнванпя — оттаивания почвы. Суть метода состоят в следующем. Отобранный для выделения актпномпцетов образец почвы помещается в нспаритель бытового холодильника прн температуре — 8'. ь1срез 1ас образец извлекается нз холодпльннка н выдерживается прн комнатной температуре до полного оттаивания.
Процедуру заморажнвания— оттаивания повторяют дважды. Затем иавеску почвы помещают в стерильную водопроводную воду, взбалтывают суспснзню в теченяе 15 мия на круговоп качалке прн 230 об/мнн, после чего различные разведения суспензнп высевают па питательную агаровую пластинку в чашках Петри. Метод замораживания — оттаивания образцов почвы позволяет обнаружнть в ннх в 1,2 — 3,6 раза больше актиномнцетов, чем в тех же образцах без замораживания. Это, по-вндямому, связано с повышением десорбцни актпномпцетоп с поверх~веги почвеинык частиц. Применение питательных сред, содержащих антибиотики. При высеве почвенной суспензия на агаровые пластинки создаются трудности для развития редко встречающихся видов актиномицетов в результате быстрого развития бактерий и широко распространенных в почвах впдов актнномпцетов.
Поэтому для целей направленного выделения определенных групп микроорганизмов в среды для высева почвенной суспсзнн добавляют различные антибиотики. Прп дооавленнн антибиотиков к среде для культивировании микроорганизмов происходит подавление обычной мпкрофлоры, создаются условия для развития устойчивых к этим антибиотикам форм микробов; последние могут оказаться новымн нлн редкими видами, способными образовывать и новые антибиотики. Для этих целей часто используют аптнбактерпальпые и протнвогрпбные препараты. Для выделения ахтпномицетов применяют среды, содержащие в своем составе такие антибиотики, как тетрацнклнны, неомнцнн, ннстатин, стрептомнцпн, хлорамфеиикол, пенициллин и др. Прн выделении продуцептов новых знтпбиотнческнх веществ используют среды, содержащие стрепгомнцнп в концентрациях от 25 до 100 мкг/мл и рубомнцнн — от 5 до 20 мкг/мл.
В случае добавления к среде стрептомпцина наблюдается значительное подавление роста наиболее часто встречающихся видов — 31герготусея йгЬеопаг~аб|1Гя, 51г. 11апосйготойепея, Яг. йгГяео!и, 51г. апгео1ас1епя, 51г. йт1яеия и др.— и выделение культур актпномицстов, которые ие обнаружквалнсь иа той же среде без стрептомнцннз.
С повышением концентрации стрептомнцнна в среде общее количество выделнемых актнномнцетов уменьшается, однако прп эгон происходит выделение новых культур актпномпцетоп. Внесение в среду для высева почвенной суспензии рубомнцниа в значительной степени подавляет рост культур актииомицетов п нокардна. Довольно устойчивыми к этому антибиотику оказались представители секций Розена, Не1чо!о-Р1акиз и А1Ьнз. В указанных условиях в значительном числе вырастают культуры актпномнцетов, не образующие воздушный мицелпй.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
