25764-1 (707534), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Изменения в морфологии клеток растений, претерпевающих ПКС, сходны с таковыми при апоптозе у животных [16, 23, 30]. Также наблюдается конденсация и дробление ядра на фрагменты, съеживание протопласта и складчатость цитоплазматической мембраны. Происходит разрыв плазмодесм – мембранных мостиков, сообщающих содержимое соседних клеток, по которым происходит распространение инфекции из зараженной клетки в соседние [31]. Сжатие протопласта приводит к отделению его от клеточной стенки. В конечном итоге протопласт дробится на отдельные везикулы, аналогичные апоптозным тельцам.

Тогда как у животных апоптозные везикулы in vivo поглощаются соседними или специализированными клетками, у растений нет таких специализированных клеток. Более того, фагоцитозу препятствует наличие клеточной стенки. Апоптозные везикулы у растений в дальнейшем разрушаются. Такая деградация может стимулироваться ферментами, секретируемыми соседними клетками. И в конечном итоге останки разрушенных клеток утилизируются другими клетками, что отмечается при отмирании листьев [22]. При отмирании листа клеточные полимеры распадаются, а мономеры вновь используются растением. Однако такой вариант заключительного этапа клеточной гибели невозможен при ГО, поскольку отмершие клетки несут в себе патоген. В этом случае образуются так называемые демаркационные, отторгающие, ткани вследствие приобретения здоровыми клетками, расположенными вокруг места поражения, меристематической активности. Возникает перидерма, отгораживающая очаг инфекции. Судьба же клеточной стенки, атрибута растительной клетки, неоднозначна. Существуют два возможных пути ее преобразования, диктуемые привязкой к событию и различающиеся конечным результатом.

Во-первых, клеточная стенка может упрочняться благодаря сшивке белков, образованию целлюлозных утолщений и лигнификации. Укрепление клеточной стенки затрудняет проникновение патогена в клетку или, напротив, способствует замуровыванию уже проникшего микроба внутри клетки. При формировании жестких сосудов проводящей системы (трахеидов ксилемы и ситовидных элементов флоэмы) на стенках соответствующих клеток образуются утолщения, которые затем укрепляются отложением лигнина.

Второй путь – разрушение клеточной стенки при участии активирующихся гидролитических ферментов. Тотальное разрушение клеточных стенок происходит при аэренхимогенезе [15]. Гидролазы действуют локально и частично растворяют клеточную стенку в отделительном слое при листопаде и при отделении созревших плодов [22].

У растений, как и у животных, наряду с апоптозом, существует некроз. Так, Н₂О₂ в малых концентрациях – индуктор апоптоза, в высоких концентрациях вызывает быструю гибель клеток, без каких-либо морфологических изменений, характерных для апоптоза [24].

Итак, наряду с делением, дифференцировкой, клеточная смерть является процессом, способствующим нормальному становлению и функционированию организма, необходимым и благоприятным для организма в целом.

Молекулярные механизмы апоптоза

Апоптоз – многоэтапный процесс. Первый этап – прием сигнала, предвестника гибели в виде информации, поступающей к клетке извне или возникающей в недрах самой клетки. Сигнал воспринимается рецептором и подвергается анализу. Далее через рецепторы или их сочетания полученный сигнал последовательно передается молекулам-посредникам (мессенджерам) различного порядка и в конечном итоге достигаетядра, где и происходит включение программы клеточного самоубийства путем активации летальных и/или репрессии антилетальных генов. Однако существование ПКС в безъядерных системах (цитопластах – клетках, лишенных ядра) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса [32].

Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз – семейства эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты (см. обзоры [33–35]). На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства а) каспазы-1 (каспазы 1, 4, 5), б) каспазы-2 (каспаза-2) и в) каспазы-3 (каспазы 3, 6–10) [36]. Цистеиновые протеазы, по-видимому, участвуют также в ПКС у растений [37]. Однако апоптоз возможен и без участия каспаз: сверхсинтез белков-промоторов апоптоза Bax и Bak индуцирует ПКС в присутствии ингибиторов каспаз [38, 39].

В результате действия каспаз происходит [33–36]:

активация прокаспаз с образованием каспаз;

расщепление антиапоптозных белков семейства Bcl-2. Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым I^CAD или DFF (DNA fragmentation factor). При апоптозе ингибитор I^CAD с участием каспаз 3 или 7 инактивируется [40], и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах – 180-200 пар нуклеотидов. Эти фрагменты при электрофоретическом разделении в агарозном геле дают характерную "лесенку ДНК". Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК [2]. Обнаружен ядерный белок Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), из которого при комбинированном действии каспазы-3 (протеолиз при Asp 1093) и неидентифицированной протеазы (протеолиз при Ser 987) образуется фрагмент Ser 987 – Asp 1093. Этот фрагмент в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК [41, 42];

гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к конденсации хроматина;

разрушение белков, участвующих в регуляции цитоскелета;

инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли(ADP-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли(ADP-рибозилирование) белков, связанных с ДНК (см. обзоры [3,11]). Донором ADP-рибозы является NAD⁺. Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD⁺, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза.

Существует несколько путей реализации программы ПКС [2, 34, 43–46].

1. Среди них важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы [34, 47–52], специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала ПКС схематически можно изобразить следующим образом: индукторы ’ рецепторы ’ адаптеры ’ каспазы первого эшелона ’ регуляторы ’ каспазы второго эшелона. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности Т_Н-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL– лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей (TNF – tumor necrosis factor). Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и TNFa , включает TNFb (лимфотоксин), TRAIL (Apo2L), CD40L, CD27L, CD30L, OX40L.

Fas – член семейства рецепторов TNF. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов (рис. 2). Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз первого эшелона (инициирующих каспаз).

Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain – домен смерти), DED (death-effector domain – домен эффектора смерти), CARD (caspase activation and recruitment domain – домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков [45, 46]. Домены DD участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD-protein) и во взаимодействии рецепторов TNFR1 и DR3 (death receptor 3) с адаптером TRADD (TNFR1-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10. Адаптер RAIDD (RIP-associated Ich-1/CED-3 homologous protein with a death domain, RIP – receptor interacting protein) связывается с прокаспазой-2 через CARD-домены [ 45, 46, 51].

Наиболее подробно охарактеризована прокаспаза-8 (FLICE/MACH/Mch5), рекрутируемая рецептором Fas через адаптeр FADD. Образуются агрегаты FasL – Fas – FADD – прокаспаза-8. Подобные агрегаты, в которых происходит активация каспаз, названы апоптосомами [43], апоптозными шаперонами [53], или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (DISC – death-inducing signaling complex) [49].

Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1–2% активности зрелой каспазы [34, 43, 54]. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокaспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга) [34, 43, 54]. В результате от прокаспазы (молекулярная масса 30–50 кДа) отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (~20 кДа) и малую (~10 кДа) субъединицы (рис. 3). Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими участками, действующими независимо друг от друга. Таким образом прокаспаза-8 активируется и высвобождается в цитоплазму в виде каспазы-8.

Существуют другие пути активации каспазы-8 – с участием рецепторов TNFR1 и DR3 [51]. Однако эти пути, включаемые одним и тем же адаптером TRADD, конкурируют с параллельными путями активации ядерных факторов транскрипции NF-єB (nuclear factor kappa B) и JNK/AP-1 (JNK, Jun-N-концевая киназа, является компонентом митоген-активируемого киназного пути, ведущего к активации фактора транскрипции AP-1), зависимыми от адаптеров RIP и TRAF (TNFR1-associated factor).под контролем этих факторов транскрипции находится синтез белковых регуляторов, которые блокируют TNF- или Apo3L-индуцированную активацию каспазы-8. Предполагаются следующие пути передачи про- и антиапоптозных сигналов [51]:

На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона (см. обзоры [36, 52, 55–58]). К ним относятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: A1, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-X_L, Brag-1, Mcl-1 и NR13) и Bax (промоторы апоптоза: Bad, Bak, Bax, Bcl-X_S, Bid, Bik, Bim, Hrk, Mtd). Эти белки эволюционно консервативны: гомолог Bcl-2 обнаружен даже у губок Geodia cydomium и Suberites domuncula, у которых апоптоз необходим для морфогенеза [59].

Каспаза-8 активирует каспазу второго эшелона (эффекторную каспазу): путем протеолиза из прокаспазы-3 образуется каспаза-3, после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым. Рис. 4 иллюстрирует взаимодействие между каспазами первого и второго эшелона. Каспаза-3 способна в дальнейшем к самостоятельной активации (автокатализу или автопроцессингу), активирует ряд других протеаз семейства каспаз, активирует фактор фрагментации ДНК, ведет к необратимому распаду ДНК на нуклеосомальные фрагменты. Так запускается каскад протеолитических ферментов,осуществляющих апоптоз.

2. В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенциал (Dy)митохондрий [34, 55, 58, 60, 61]. Падение Dy обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий (permeability transition) вследствие образования гигантских пор [62]. Разнообразны факторы, вызывающие раскрытие пор [60]. К ним относятся истощение клеток восстановленным глутатионом, NAD(P)H, ATP и ADP, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорелирования протонофорными соединениями, увеличение содержания Ca²⁺ в цитоплазме. Образование пор в митохондриях можно вызвать церамидом, NO, каспазами, амфипатическими пептидами, жирными кислотами [60]. Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия поры является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема [63]. Среди этих белков – ряд апоптогенных факторов: цитохром с [64–66], прокаспазы 2, 3 и 9 [67, 68], белок AIF (apoptosis inducing factor), представляющий собой флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа [69]. Прокаспаза-3 обнаруживается как в межмембранном объеме митохондрий, так и в цитоплазме [67].

Характеристики

Список файлов реферата