94748 (682267), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Макропористий гідрогель (полі[N-(2-гідроксипропіл)-метакриламід]) був синтезований в лабораторії E. Pinet (FISO Technologies Inc., Quebec, Canada) шляхом гетерогенної полімеризації із наступним очищенням у спиртових і водяних ваннах, після чого гідрогель стерелізували у дистильованій воді шляхом автоклавування і запаювали в скляні ємності. Росфасований в стерильних умовах після транспортування гідрогель утримували протягом усього експерименту при температурі 6–8 С. Вміст однієї пробірки використовували для імплантації 4–6 тваринам протягом одного операційного дня.
Вивчення ефективності імплантації гідрогелю та алотрансплантації клітин НЦ на моделі ЛПП спинного мозку проводили на білих безпородних щурах-самцях, вагою 250–300 г та середнім віком 5–6 міс. У ході дослідження були сформовані наступні експериментальні групи: група „контроль” – моделювання ЛПП спинного мозку (n=24); група „гідрогель”, тваринам якої безпосередньо після нанесення травми в ділянку ушкодження спинного мозку імплантували гідрогель (n=37); група, тваринам якої через 4 тиж після нанесення травми й імплантації гідрогелю в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=12); група, тваринам якої через 8 тиж після нанесення травми й імплантації гідрогелю в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=8); група, тваринам якої через 7 тиж після нанесення травми в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=4); група, тваринам якої через 13 тиж після нанесення травми в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=4). Група тварин, котрим через 4 тиж після моделювання травми та імплантації гідрогелю трансплантували клітини НЦ була розділена на дві підгрупи: тварини із кращими (n=5) та гіршими (n=7) показниками відновлення функції задньої іпсилатеральної місцю травми кінцівки (ЗІК) на момент виконання ТКНЦ. Для порівняльної оцінки даних електрофізіологічного дослідження провідності спинного мозку було сформовано групу інтактних тварин (n=11).
У якості моделі травматичного пошкодження спинного мозку була використана модель його лівобічного половинного перетину (ЛПП) в нижньогрудному відділі. Оперативні втручання здійснювали під загальним знеболенням, що досягалося шляхом внутрішньоочеревинно введення суміші розчинів ксилазину (Sedazіn, Bіowet, Польща) з розрахунку 15 мг/кг маси і кетаміну (Calypsol, Gedeon Rіchter) з розрахунку 70 мг/кг маси. Ламінектомію проводили на рівні ТXI, зберігаючи при цьому суглобові відростки. Після наскрізного проколу офтальмологічним списоподібним скальпелем тканини спинного мозку вздовж лівого краю задньої серединної артерії (лезо скальпеля знаходилося у сагітальній площині, а рукоятка – перпендикулярно дорзальній поверхні спинного мозку) у рану спинного мозку заводили одну з бранш офтальмологічних ножиць таким чином, щоб при повному їх відкритті в проміжку між браншами потрапляла тканина усієї лівої половини поперечника спинного мозку (ножиці встановлювали рукоятковою частиною в площині поперечного перерізу спинного мозку, перпендикулярно дорзальній його поверхні). В декілька прийомів проводили перетин тканини лівої половини поперечника спинного мозку. Контроль повноти перетину проводили за допомогою скривленого по ребру офтальмологічного пінцета.
В область дефекту тканини спинного мозку імплантували фрагмент гідрогелю. Протибактеріальну терапію здійснювали за допомогою одноразового введення необхідної дози біциліну-3 або біциліну-5. У якості протизапальної і протинабрякової терапії використовували введення розчину дексаметазону.
Техніка формування доступу на рівні ТXII–LI під час повторного втручання з приводу ТКНЦ аналогічна описаній вище. Клітинну суспензію вводили в тканину спинного мозку на вказаному рівні нижче місця травми за допомогою інсулінового шприца як гомолатерально, так і контрлатерально по відношенню до вогнища травми в загальному об’ємі 0,075 мл (2,25106 живих клітин). Окрім цього, клітинну суспензію вводили в субарахноідальний простір у ділянці сформованого операційного доступу в об’ємі 0,06 мл (2106 живих клітин).
Оцінку функціональної активності задніх кінцівок прооперованих тварин проводили згідно із 21-бальною шкалою, запропонованою D.M. Basso, M.S. Beattie та J.C. Bresnahan (ВВВ, 1995). З метою встановлення більш тонких особливостей динаміки відновного процесу проводили дослідження величини швидкості зміни показника функції (ПФ): швидкість зміни ПФ (бали/тижні) = ПФ станом на кінець попереднього тижня – ПФ станом на кінець наступного тижня.
З метою коректного висвітлення ефективності ТКНЦ вибірки зрівняння формували з урахуванням спектру індивідуальних значень ПФ ЗІК на момент проведення ТКНЦ.
Електрофізіологічне дослідження здійснювали під загальним знеболенням (див. вище). Широко відкривали канал хребта на рівні ТIII–TV, мобілізували спинний мозок вздовж двох сегментів і під його вентральну поверхню перпендикулярно ростро-каудальній осі підводили 2 паралельні гачкоподібні кінці стимулюючого сталевого електроду.
Реєструючі активний та пасивний голкові сталеві електроди встановлювали у товщу рухової точки бічного широкого м’язу стегна обох кінцівок. Стимуляцію та обробку первинних результатів проводили за допомогою електронейроміографа з системою комп’ютерного аналізу потенціалів B.A.S.I.S. Е.Р.М. (OTE Biomedica, Італія). Для подальшого аналізу відбиралися найвищі отримані впродовж дослідження однієї тварини показники. При цьому визначали такі показники електричної активності нервово-м’язового апарату, як максимальна амплітуда (МА) М-відповіді м’язу, латентний період реєстрації та швидкість проведення збудження (ШПЗ).
Статистичну обробку первинних цифрових даних здійснювали на персональному комп’ютері за допомогою програмного забезпечення STATISTICA 6.0 та пакету MS Exel. Під час порівняльної оцінки результатів моніторингу функції задніх кінцівок встановлювали достовірність різниці середнього бального показника у порівнюваних групах та підгрупах за допомогою непараметричного методу U-тест Мана-Уітні (Mann-Whitney U-test).
Під час статистичної обробки результатів електрофізіологічного дослідження у кожній із вибірок проводили перевірку на нормальність розподілу змінної за допомогою тесту Шапіро-Уілка (Shapiro-Wilk test), після чого достовірність різниці між середніми показниками вибірок встановлювали за допомогою t-тесту.
Гістологічні та електронно-мікроскопічні дослідження проводили згідно із загальноприйнятими протоколами (Г.А. Меркулов, 1961; Г. Гайер, 1974). Імуногістохімічне дослідження експресії віментину в клітинних культурах здійснювали за допомогою стандартного набору “Immunochemicals” (Sigma).
Гістологічні препарати вивчали за допомогою світлооптичного мікроскопа Axiophot (OPTON, Німеччина) та цитоаналізатора зображення IВAS-2000 (KONTRON, Німеччина) з наступною цифровою та аналоговою фотореєстрацією. Електронно-мікроскопічне дослідження проводили на електронному мікрокопі ЕМ-400Т (PHILIPS, Нідерланди).
Результати та їх обговорення. Використання моделі ЛПП у даному дослідженні дозволило провести коректну оцінку впливу імплантації гідрогелю на провідники та нейрональні клітини спинного мозку у ранньому періоді спінальної травми з урахуванням віддаленого функціонального ефекту, що за ряду об’єктивних причин неможливо здійснити на моделях повного перетину або забиття спинного мозку.
Порівняння результатів ОПП, представлених різними дослідницькими групами (C.D. Mills та співавт., 2001; Y.S. Gwak та співавт., 2004), з отриманими нами даними дає можливість стверджувати, що використаний протокол моделювання ОПП з огляду на поставлені завдання дослідження є найбільш прийнятним і забезпечує максимальне наближення посттравматичного дефіциту функції ЗІК до дефіциту функції задніх кінцівок, що виникає після повного перетину спинного мозку на аналогічному рівні. Використання запропонованої моделі ОПП дало змогу виділити у групах „контроль” та „гідрогель” дві рівновеликі підгрупи: із кращими та гіршими показниками відновлення функції ЗІК. При цьому аналогічність варіативного розподілу величини ПФ у групах „контроль” та „гідрогель” відкрила можливість проведення адекватного порівняльного статистичного аналізу між вказаними підгрупами.
Станом на 16-ий тиждень спостереження було отримано наступні дані щодо величини середнього ПФ у групах „контроль” та „гідрогель”. Стосовно ЗІК: 7,23 проти 4,69 (в загальному по групах „гідрогель” і „контроль” відповідно) (рис. 1), 2,88 проти 0,59 (підгрупи груп „гідрогель” та „контроль” із гіршими показниками відновлення) та 10,26 проти 8,23 балів ВВВ (підгрупи груп „гідрогель” і „контроль” із кращими показниками відновлення). Стосовно ЗКК: 13,03 проти 10,6 (в загальному по групах „гідрогель” і „контроль” відповідно) (рис. 2), 12,41 проти 10,45 (підгрупи груп „гідрогель” та „контроль” із гіршими показниками відновлення) та 13,17 проти 10,73 балів ВВВ (підгрупи груп „гідрогель” і „контроль” із кращими показниками відновлення). Отже, згідно із цими даними, імплантація гідрогелю призводить до достовірного покращення функції задніх кінцівок, що станом на 16-ий тиждень у різних досліджуваних вибірках виражається величинами у межах 2–2,54 бала ВВВ.
Інваріантність величини позитивного впливу імплантації гідрогелю на відновлення функції задніх кінцівок знаходить адекватне пояснення. Відомо, що зростання складності функціональної активності кінцівки супроводжується залученням все більшого об’єму волокон та інтернейронного апарату спинного мозку (H. Majczynski, U. Slawinska, 2007). Регенераційні перебудови при ушкодженні певної частини спинного мозку здійснюються в межах апарату, який повністю чи частково причетний до генерування функціональної активності цієї частини інтактного спинного мозку. Отже, чим глибше ураження вказаної частини спинного мозку, тим менший об’єм її функціонального апарату залишається неушкодженим, тим нижчий рівень її функціональної активності, однак, тим менші можливості регенераційного відновлення. І, навпаки, при більшому об’ємі збереження спостерігається більш високий рівень функціональної активності ушкодженої функціональної частини спинного мозку, що потребує більш широких пластичних перебудов для досягнення позитивного результату, однак це стає можливим лише у тій мірі, в якій широта регенераційних змін визначається об’ємом первинної збереженості нервових структур.
Порівняльний аналіз динаміки середньої величини ПФ задніх кінцівок у різних підгрупах дозволив виділити у посттравматичному періоді кілька фаз (рис. 3), що пов’язані, на нашу думку, із етапною реалізацією різних механізмів відновного процесу.
Перша фаза відновлення функції спинного мозку триває протягом 1-го тижня після нанесення травми і пов’язана, на нашу думку, із відновленням функції провідності волокон, що зазнали найменш значного ураження. Друга фаза (2-3-ій тиждень – у групі „гідрогель” та 3-4 тиж у групі „контроль”) характеризується, на нашу думку, відновленням волокон, котрі зазнали більш значного, демієлінізуючого впливу. Суттєві відмінності у поведінці показника швидкості відновлення функції задніх кінцівок груп „гідрогель” та „контроль”, дозволяють стверджувати, що імплантація гідрогелю призводить до зростання частки волокон, котрі зазнали слабкого ураження за рахунок зменшення частки волокон, що отримали більш значне ураження.
Третя фаза інтенсифікації відновного процесу припадає на 4-ий тиждень в обох групах і, очевидно, відображає результативність не лише відновлення волокон, що зазнали демієлінізуючого впливу (більш характерно для групи „контроль”), але й у деякій мірі – пластичних перебудов систем низхідного проведення збудження.
Четверта фаза у випадку групи „контроль” припадає на 7–9-ий тиждень спостереження, тоді як у групі „гідрогель” її ініціація прослідковується уже на 5-му тижні і тривалість обмежується кінцем 8-го тижня спостереження. У цій фазі виявляється втрата спряженості між об’ємом збереженості субстрату регенераційного процесу та функціональною результативністю перебудов, що вказує на високе значення реалізації таких механізмів прояву пластичності нейрональних сіток, як формування довгих розгалужень нейритів під час спраутингу, регенераційне проростання аксональних відростків у каудальні відділи спинного мозку тощо. Виходячи із даних порівняльного аналізу динаміки ПФ на цьому інтервалі відновного процесу, слід визнати, що гідрогель позитивно впливає на перебіг вказаних трансформацій, прискорюючи їх ініціацію. Ці висновки знаходить підтвердження і у даних морфологічних досліджень, котрі свідчать, що ніжна сполучна тканина в товщі гелевого імплантату, а також у складі оточуючої капсули, починаючи з 3-го тижня після імплантації, стає зоною проростання волокон дрібного та середнього калібру.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
