94011 (681776), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Прибор для подсчета фотонов состоит из биметаллического фотоумножителя типа EMI 9893 QA/350 в неохлаждаемом блоке ТЕ 1004/TS/110 и светопроводяще-го стеклянного стержня, который соединен с интерференционным фильтром, пропускающим короткие волны. Сигнал на ФЭУ предварительно усиливается и подается на блок дискриминатор - счетчик фотонов. Держатель с нагревательным элементом и образцом соединяют с блоком ФЭУ таким образом, чтобы оставался небольшой свободный объем камеры, который продувается слабым током газообразного азота. Принципиальная схема и внешний вид прибора представлены на рис. 14-16.

В полностью автоматизированной системе робот Movemaster перемещает диски с пробами к нагревателю и затем закрывает камеру. Далее включаются питание блока ФЭУ и нагреватель пробы. По завершении определенного периода нагревания питание блока ФЭУ отключается, робот открывает камеру, извлекает и отбрасывает пробу. Результаты измерения ТХЛ регистрируются и обрабатываются компьютером Apple, который контролирует всю систему, а также строит калибровочный график. Обсуждаемая система способна обрабатывать 4 специальных микротитровальных планшета стандартного размера, содержащих в общей сложности 240 проб. Система отличается исключительно высокой гибкостью, что позволяет применять ее в исследовательских работах при разработке любых анализов на основе ТХЛ-меток.

Определение хорионического гонадотропина человека с помощью термохемилюминесцентного иммуноанализа

Разработана методика двухсайтового твердофазного термохемилюминесцентного иммуноанализа для определения хорионического гонадотропина человека с использованием дисков из каптона-500Н, на которые нанесены моноклинальные антитела против hCG и моноклональные антитела против другого эпитопа,.содержащие несколько остатков ТХЛ-метки. В этом анализе принцип усиления не применялся.

Приготовление меченых антител. К моноклональным мышиным антителам против hCG, растворенным в 1мл 0,9% NaCl, добавляют 1мл 100 мМ боратного буфера и затем 200 мкл раствора соединения VIII в 1,4-диоксане. Раствор осторожно перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливают диализом против боратного буфера при 4°С. Как показало измерение активности ТХЛ-метки этого конъюгата, эффективность введениях метки равна 40%.

Иммунная реактивность конъюгата моноклональных антител против hCG с 10 остатками соединения VIII подтверждена методом иммуноферментного анализа типа ELISA путем изучения конкурентного связывания в сравнении с коныогатом моноклональных антител против hCG с пероксидазой хрена. Удельная активность ТХЛ-метки полностью сохранялась при добавлении бычьей сыворотки и стандартов hCG.

Выполнение анализа. На диски из каптона-500Н наносят специфические мышиные моноклональные антитела против /3-цепи hCG, дважды промывают боратным буфером и инкубируют в течение ночи с 160 мкл стандарта hCG, содержащего 40% бычьей сыворотки, 50-60% боратного буфера и 19 мкг/мл меченого конъюгата. На рис. 17 представлена калибровочная кривая, построенная по усредненным результатам 5 измерений. Интенсивность ТХЛ определяли с помощью автоматической системы, описанной в предыдущем разделе.

Заключение

Обладающие хемилюминесцентной активностью соединения можно получить в форме, позволяющей связать их с компонентами иммунохимической реакции. При использовании в качестве ТХЛ-меток. устойчивых 1,2-диоксетанов для количественного определения меченых соединении достаточно одного нагревания. По указанным ниже причинам для этой цели особенно удобны 1,2-диоксетаны, получаемые из различных функционально-замещенных адамантилиденадамантанов.

1. Термическая, а также химическая устойчивость этих меток позволяет долго хранить как сами метки, так и их коньюгаты, применять буферные растворы с широким диапазоном рН, компоненты сыворотки и органические растворители, не опасаясь заметного разложения этих меток.

2. Термохемилюмннесцентные реакции - это процессы первого порядка. Поэтому кинетика реакции не зависит от содержания метки в пробе. Ошибочные измерения можно отбросить с помощью алгоритма подгонки кривой.

3. Для измерения интенсивности ТХЛ не нужны дополнительные химические реагенты.

4. ТХЛ-меткн легко синтезировать с высоким выходом, воспроизводимой высокой степенью чистоты и высокой удельной активностью.

5. Так как эти метки бесцветны, самогашение не наблюдается и в белки можно вводить большое число меток без потери удельной активности.

6. Хотя удельная активность диадамантил-1,2-диоксетанов невысока, интенсивность ХЛ можно увеличить в 40 раз за счет переноса энергии к термически устойчивым флуорофорам, например СКП-9,10-дифенилантрацену. При добавлении акцепторных соединений типа флуоресцеина или рубрена наблюдается сдвиг ТХЛ в красную область спектра.

7) В небольшие белки можно вводить большое число ТХЛ-меток и остатков ДФА; таким образом, получают эффективно термохемилюминесци-рующий белок, который в свою очередь можно использовать как водорастворимую метку. В настоящее время удается определять ТХЛ только сухих проб, выдерживающих нагревание до 250°С; водные растворы анализировать нельзя. Большинство элементов этого нового метода постоянно совершенствуются, но наиболее существенного улучшения следует ожидать от разработки системы нагревания проб, в которой повышение температуры должно быть очень быстрым, строго локализованным и осуществляться точно по заданной программе. Методика определения hCG убедительно показывает, что цели, стоящие перед иммуноанализами типа ТИА и FATIMA, вполне достижимы.

Характеристики

Список файлов реферата