93884 (681697), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Иногда используют жидкость Рубенкова, которая состоит из основного фуксина – 0,1 г, красителя Романовского – 0,02 мл, концентрированной карболовой кислоты – 0,2 мл, глицерина – 0,1 мл, этилового спирта ректификата – 2 мл, 1% раствора натрия хлорида – 100 мл. Эта жидкость кроме фиксации окрашивает сперматозоиды, что дает возможность оценить морфологию сперматозоидов – сперматограмму.

Камеру готовят для микроскопии, так же, как было описано ранее. Для более удобного исследования рекомендуется выдержать камеру Горяева во влажной среде специального устройства. Это необходимо для оседания клеточных элементов.

Исследование проводится путем микроскопии световым микроскопом (или фазово-контрастным) при увеличении 200х (объектив 20х и окуляр 10х). Подсчет сперматозоидов происходит внутри квадратов камеры Горяева. Если клетка расположена на границе между квадратами, то пользуются правилом подсчета только на одной стороне камеры (правой или левой). Подсчет проводится сперматозоидов, имеющих головку и жгутик. Если встречаются аномальные сперматозоиды, например, без жгутика, то они в подсчет не входят.

Техника подсчета следующая:

• если в одном большом квадрате камеры имеется более 40 сперматозоидов, то подсчету подлежат сперматозоиды, находящиеся в пяти больших квадратах;

• если количество клеток составляет от 10 до 40, то исследуются десять больших квадратов, и если имеется менее чем 10 сперматозоидов, то подсчитываются сперматозоиды, лежащие в 25 квадратах.

Принцип подсчета основан на том, что зная все размеры камеры, соответственно ее объем, можно определить концентрацию клеток, находящихся в данном объеме.

Итак, вначале определяется количество малых квадратов, которые расположены в пяти больших. Это число равно 80 (16 * 5 = 80). Далее определяется объем малого квадрата, который составляет 1/4000 кубических миллиметра (V = 0, 05 мм * 0,05 мм * 0,1 мм = 1/4000 кубических миллиметра). После чего подсчитывается количество сперматозоидов в одном малом квадрате. Это число делят на число малых квадратов (N/80). Определяется число сперматозоидов в 1 кубическом миллиметре. Это выполняется так:

• в 1 кубическом миллиметре объема камеры содержится в 4000 раз больше сперматозоидов, чем в одном малом квадрате.

Формула подсчета числа клеток в 1 кубическом миллиметре следующая:

C = N * 4000/80 = N * 50 (сперматозоидов / кубический миллиметр). Поскольку 1 мл содержит 1000 кубических миллиметра, соответственно количество сперматозоидов в 1 мл определяется по формуле:

C (1 мл) = (N * 50) * 10³ (сперматозоидов / мл).

В конце учитывается степень разведения эякулята:

C (общее) = N * 50000 * степень разведения яээкулята.

При проведении подсчетов сперматозоидов в десяти или двадцати пяти больших квадратах следует помнить, что количество малых квадратов будет равно 16 * 10 или 16 * 25. И тогда в формулы подсчета вносятся значения 160 или 400.

Для того чтобы определить концентрацию сперматозоидов во всем эякуляте, необходимо умножить количество клеток в 1 мл эякулята на весь его объем. Для контроля необходимо провести второй подсчет из двух разных порций спермы. Если разница числа сперматозоидов составляет более 5%, то такой результат считают недостоверным и проводят исследование заново.

Нормы концентрации сперматозоидов

Нормы концентрации сперматозоидов рекомендованы ВОЗ в 1992 году и являются общепризнанными во всем мире.

Нижняя граница числа сперматозоидов 1 мл эякулята должна составлять 20 миллионов. Неоднократно наблюдали наступление беременности в тех случаях, если эта цифра была равна 10 – 12 миллионов.

Снижение числа сперматозоидов (менее 20 миллионов в 1 мл спермы) носит название олигозооспермия. Если в 1 мл эякулята содержится от 10 до 20 миллионов сперматозоидов, то такая олигозооспермия считается 1 степени. Если концентрация сперматозоидов составляет менее 10 миллионов в 1 мл, то это олигозооспермия 2 степени.

Если в эякуляте вообще отсутствуют сперматозоиды, то данное состояние называется азооспермией. При наличии единичных сперматозоидов, определенных после центрифугирования эякулята присваивается термин – криптоспермия.

Если в 1 мл эякулята число сперматозоидов превышает цифру 150 миллионов, то тогда данное состояние называется гиперспермией. По некоторым данным эта цифра равна 120 миллионам.

Оценка подвижности сперматозоидов

Оценка подвижности сперматозоидов выполняется путем микроскопии препарата спермы на обычном предметном стекле и камере Горяева. Опытный врач-лаборант начинает исследования с микроскопии нативного препарата на предметном стекле. Для получения точных значений подсчет проводится в счетной камере. Вначале просматриваются пять больших квадратов, которые расположены по диагонали. Если концентрация сперматозоидов мала (сумма клеток в пяти квадратах менее 150), то осмотру подлежит большее число квадратов. Также возможно использовать меньшую степень разведения эякулята.

Согласно критериям ВОЗ различают следующие варианты подвижности сперматозоидов:

1. a – сперматозоиды с быстрым поступательным движением (скорость движения таких сперматозоидов составляет более чем пять длин головок или половины хвоста за 1 секунду, при +37⁰C). Стоит сказать, что определение этого параметра достаточно субъективно и в первую очередь зависит от опыта врача, проводившего исследование.

2. b – сперматозоиды с медленным поступательным движением (скорость движения таких сперматозоидов составляет менее чем пять длин головок или половины хвоста за 1 секунду, при +37⁰С).

3. c – сперматозоиды с непоступательным движением (или же крайне медленным поступательным движением по прямой). Сюда же относят сперматозоиды, имеющие движение по кругу, даже если эта скорость велика.

4. d – неподвижные сперматозоиды.

Техника исследования следующая:

• вначале считаются сперматозоиды с подвижностью типов a и b. Это исследование рекомендуется выполнять в двух оптических плоскостях – верхней и нижней.

• Затем определяется число сперматозоидов с подвижность типа c и d.

Значениями являются%. Формулы получения значений следующие:

• a = a * 100/(a+b+c+d),

• b = b * 100/(a+b+c+d),

• c = c * 100/(a+b+c+d),

• d = d * 100/(a+b+c+d).

Полученные значения округляют.

Еще одним важным критерием является определение длительности сохранения подвижности. При этом контейнер с образцом спермы выдерживается в термостате при стандартной +37⁰С в течение 2-х часов. После чего проводятся повторное изучение подвижности сперматозоидов. За это время ухудшение показателей подвижности в норме составляет не более 20%.

Оценка достоверности исследования заключается в повторном исследовании. Для 50 исследуемых сперматозоидов допускается отклонение до 5 клеток в двух образцах спермы. Для 100 сперматозоидов эта цифра составляет менее 7 и для 250 – не более 9.

Нормы подвижности сперматозоидов

Чем больше число сперматозоидов с активной прогрессирующей подвижностью, тем выше фертильность спермы. В настоящее время в качестве норм подвижности рекомендуется использовать значения ВОЗ:

• Количество прогрессивно подвижных сперматозоидов (a + b) должно составлять не менее 50%. Число активно подвижных сперматозоидов (a) в норме считают не менее 25%.

• Неподвижных сперматозоидов (d) должно быть менее 50% и

• сперматозоидов с отсутствием поступательного движения (c) не более 2%.

Однако значения физиологической нормы могут быть весьма вариабельны, и наступление беременности происходит и при значительно худших показателях подвижности сперматозоидов, чем нормы ВОЗ.

Причины нарушения подвижности сперматозоидов

Снижение числа подвижных сперматозоидов называется астенозооспермия. Существует множество классификаций степени астенозооспермии:

• Если суммарный процент прогрессивно–подвижных сперматозоидов (a + b) составляет менее 50%, то такую астенозооспермию считают слабовыраженной.

• Если это значение меньше 40%, то говорят об умеренной астенозоооспермии.

• И если имеется лишь 30% подвижных сперматозоидов, то тогда говорят о выраженной астенозоооспермии.

Причин, которые в той или иной степени действуют на показатели подвижности, множество. Это могут быть как экзогенные, так и эндогенные факторы. Из экзогенных стоит выделить следующие:

• неблагоприятные факторы внешней среды,

• различные токсические влияния,

• колебания климатических показателей,

• злоупотребление алкоголем,

• курение,

• действие электромагнитного излучения,

• неблагоприятные условия работы.

Из эндогенных факторов в первую очередь стоит отметить различные аномалии строения и функционирования жгутикового аппарата сперматозоидов. Среди них известны генетические нарушения, которые изменяют нормальное строение аксонемы и ферментопатии, что приводит к нарушениям энергетических процессов, происходящих во время движений жгутиков. Часто это клеточные нарушения, например, патология митохондрий.

Кроме того, известно, что хронические воспалительные процессы придаточных половых желез (вызванные как специфической, так и неспецифической урогенитальной инфекцией) оказывают существенное отрицательное влияние на подвижность сперматозоидов. Это обусловлено токсическим влиянием продуктов воспаления, замещением соединительной тканью функционирующей части желез, а также уменьшением секреции в придатке яичка так называемых андроген-зависимых факторов, необходимых для обеспечения механизмов подвижности сперматозоидов. Также не исключен такой фактор, как аутоиммунный процесс, приводящий к нарастанию титра антиспермальных антител.

Оценка жизнеспособности сперматозоидов

Оценка жизнеспособности сперматозоидов проводится следующим образом: после разжижения сперма перемешивается пипеткой, далее на предметное стекло помещается капля неразведенного эякулята. На препарат наносится 1% водный раствор эозина.

Лучшим методом окраски считается окраска по Блуму. На предметное стекло рядом с каплей спермы помещают вдвое большую каплю 5% раствора эозина и каплю 10% водного раствора нигрозина, вдвое большую, чем капля эозина. Сначала эякулят смешивают с каплей эозина, выжидают несколько секунд. Далее препарат смешивают с каплей нигрозина и снова выжидают. После чего делается мазок, аналогичный мазку крови. После высушивания приступают к микроскопии.

Препарат накрывается обычным покровным стеклом и через 2 минуты микроскопируется при увеличении 400х (объектив 40х, окуляр 10х). Конденсор микроскопа вначале опускается. Поскольку живые сперматозоиды не окрашиваются, а мертвые окрашиваются в розовый цвет, то достаточно просто их отличить друг от друга. Подчитывается общее число сперматозоидов в поле зрения (желательно не менее 500). Далее конденсор поднимается и ведется подсчет мертвых сперматозоидов. Процентное содержание мертвых сперматозоидов определяется по формуле:

Cмертв. = C розовые/C общие * 100%.

В норме число живых сперматозоидов должно быть более 75%, однако неоднократно наблюдается наступление беременности и при меньших значениях. Повышение числа мертвых сперматозоидов свыше 25% носит название – некрозооспермия. Причины появления мертвых сперматозоидов различны и до конца не выяснены. Возможно, что это связано с патологией придатка яичка.

Иногда используется индекс нормальных подвижных сперматозоидов (ИНПС) определяется по формуле:

ИНПС = V * C * A * B/10⁶,

где V – это объем эякулята,

C – концентрация сперматозоидов,

A – процент сперматозоидов с прогрессивной подвижностью (a +b) и

B – процент морфологически нормальных сперматозоидов.

Если значения индекс нормальных подвижных сперматозоидов больше или равен 6*10⁴, то это говорит о нормальной фертильности.

Оценка морфологии сперматозоидов

Оценка морфологии сперматозоидов (сперматограмма) проводится на неокрашенных препаратах, после обездвиживания в счетной камере. Морфологическая структура сперматозоидов является важным критерием диагностического звена, поскольку наряду с подвижностью этот параметр определяет фертильность спермы. Исследование желательно проводить при помощи фазово-контрастного микроскопа. Анализируется тот же препарат, что и для оценки подвижности клеток.

Проводится подсчет общего числа сперматозоидов в 5 больших квадратах камеры. При этом вначале можно определить число сперматозоидов с ненарушенной подвижностью и нормальным морфологическим строением. Затем изучается процент этих сперматозоидов от общего числа. Также для исследования приготавливается окрашенный препарат (мазок). Для этого используют предметные стекла, которые обезжириваются путем обработки 70⁰ спиртом. На высушенное стекло наносится капля эякулята после полного разжижения. Капля разносится по поверхности стекла с помощью другого, краем, под углом в 45⁰. Необходимо этот процесс осуществлять деликатно, что бы не допустить раздавливания препарата. Распределение материала на стекле происходит за счет капиллярных сил.

Микроскопия вначале проводится при малом увеличении. В норме в поле зрения микроскопа должно быть не менее 30 сперматозоидов, равномерно распределенных по стеклу. Окраска препарата выполняется гематоксилин-эозином. Также используется метод окраски по Папаниколау, Шору и Май-Грюнвальду-Гимзе. Исследование наиболее информативно при окраске по Папаниколау.

Мазки микроскопируют при большом увеличении 900х (иммерсионный объектив 90х, окуляр 10х). Процент морфологически нормальных сперматозоидов определяется по формуле:

N/C * 100%,

где C это число всех подсчитанных сперматозоидов,

N – число сперматозоидов с нормальной морфологией.

Общее число аномальных сперматозоидов вычисляется следующим образом:

C – N.

Эта цифра принимается за 100% для подсчета в процентном соотношении сперматозоидов с различной формой аномалии.

Например, для подсчета сперматозоидов с аномалией головки в процентах используется формула:

Характеристики

Список файлов реферата