92285 (680559), страница 2
Текст из файла (страница 2)
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження. Дослідження проведене на 28 статевозрілих кролях-самцях породи „шиншила” на базі Науково-експериментальної клініки Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. Усі втручання та забій тварин проводили з дотриманням міжнародних принципів «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985р.), „Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”, ухвалених Першим Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001р.). Комісією з питань біоетики Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (протокол № 7 від 25 січня 2006 р.) порушень у проведенні досліджень не виявлено.
Модель дисліпопротеїдемії була створена за класичною методикою Анічкова шляхом перорального введення кристалічного холестерину на соняшниковій олії з морквою в дозі 0,5 г/кг маси тіла кроля протягом 3 місяців. Піддослідні тварини були розподілені на 5 груп: 1 група - інтактні тварини, які утримувались в звичайних умовах віварію, 2- тварини з експериментальною дисліпопротеїдемією (ЕДЛП) без подальшого лікування, 3 - тварини з ЕДЛП, яким в наступні 30 діб проводили корекцію даної патології препаратом вінборон (5 мг/кг), 4 – група тварин на тлі змодельованої патології в наступні 30 діб отримувала препарат пентоксифілін (5 мг/кг); 5 – група, якій також в наступні 30 діб проводили корекцію ЕДЛП препаратом вінпоцетін (2 мг/кг).
Для біохімічного дослідження забирали кров із крайової вени вуха тварин і визначали наступні показники ліпідного обміну: загальний холестерин (ЗХ) (за методом Ілька), ліпопротеїни низької щільності (ЛПНЩ) - за методом В.В. Меньшикова з гепариновим реактивом (1987), фосфоліпіди (ФЛ) - за методом А.А.Пентюка, (1985), тригліцериди (ТГ) (реактивом Наша), ліпопротеїни високої щільності (ЛПВЩ) (за методом Ілька), та розраховували індекс атерогенності (ІА) (співвідношеня загального холестерину і фосфоліпідів).
Рівень мозкового кровотоку визначали в кінці досліду під тіопенталовим наркозом за допомогою флоуметра (вимірювача об’ємної швидкості кровотоку) Transonic Animal Research Flowmeters T 106 Series. Приваскулярний датчик Transonic Flowprobe 2RB1071, накладений на внутрішню сонну артерію, фіксував швидкість мозкового кровотоку (мл/хв). Результати моніторування були зафіксовані на жорсткому диску комп’ютера у вигляді графічних даних. Вимірювання рівня мозкового кровотоку проводили протягом 30 хв. фіксуючи показники об’ємної швидкості мозкового кровотоку (ОШМК) кожні 5 хвилин експерименту. За 100% було взято швидкість мозкового кровотоку в початковий стан вимірювання.
По закінченню досліду всім піддослідним та інтактним тваринам проводили евтаназію тіопенталовим наркозом і для подальшого дослідження забирали головний мозок, який для фіксації поміщали разом з черепом в 10 % розчин нейтрального формаліну. Перед цим череп звільняли від м’язів голови, видаляли нижню щелепу та частину верхньої для кращого доступу фіксуючої рідини до мозку. Через 8-10 діб мозок відпрепаровували від черепа і залишали для дофіксації у 10 % розчині формаліну.
Масу тварин визначали на настільних вагах типу РН-10ц УЗ, а масу головного мозку – за допомогою ваг лабораторних типу ВЛР-200. Об’єм головного мозку визначали за формулою A.N. Iwaniuk (1992). Мозковий індекс визначали за співвідношенням маси головного мозку до маси тіла тварини (Г.Г. Автандилов, 1990). Лінійні величини – довжина, висота мозку, а також довжина і ширина півкуль головного мозку були отримані за допомогою штангенциркуля за вказаними у літературі схемами (H. Stephan, 1981).
Виготовлення целоїдинових блоків проводили за загальноприйнятими методиками (О.В.Волкова, 1982). Для різки целоїдинових блоків використовували санний мікротом МС-2. Отримані целоїдинові зрізи фарбували за класичним методом Ф. Нісля, а заморожені – по Лізону суданом чорним-В для виявлення загальних ліпідів. Оцінку мікропрепаратів проводили під мікроскопом МІКМЕД-1 при різних збільшеннях (окуляр 10, об’єктив 8, 20, 40, 90).
Для вимірювання мікрометричних характеристик використовували програмне забезпечення UTHSCSA Image Tool® for Windows® (version 2.00) (Відео Тест – розмір 5.0) в інтерактивному режимі з використанням об’єктива x40 і фотоокуляра x10. Топографію та цитоархітектоніку кори головного мозку визначали за атласом мозку кролика С.М. Блінкова (1973). На целоїдинових зрізах товщиною 8 - 10 мкм, забарвлених за методом Ф. Нісля, вимірювали площу профілю та діаметр нейроцитів, ядер та ядерець пірамідних нейронів третього та п’ятого шарів кори головного мозку. Використовуючи дані цих вимірювань, визначали об’єм клітин, їх ядер, ядерець, та ядерно-цитоплазматичне співвідношення. Об’єми розраховували за формулою С.М. Блінкова (1964). На целоїдинових зрізах визначали вміст різних типів нейронів пірамідного та гангліонарного шарів сенсомоторної кори головного мозку: нормохромних, гіпохромних, різко гіпохромних, гіперхромних, різко гіперхромних, що відображають різний морфофункціональний стан цих клітин (Н.Н. Боголепов, 2003). Морфометрію артерій м’якої мозкової оболонки проводили за методикою С.В. Шорманова (1982). Досліджували судини малого калібру: визначали площу поперечного перерізу артерій, площу просвіту, зовнішній і внутрішній діаметр, товщину стінки та індекс Вогенворта.
Для електронномікроскопічного дослідження шматочки сенсомоторної кори головного мозку (поле 4) вирізали із правої півкулі, та фіксували 2,5 % розчином глютарового альдегіду на фосфатному буфері (рН 7,4), дофіксовували 1 % розчином осмію. Заливали в суміш епоксидних смол (Епон 812). Зрізи виготовляли на ультрамікротомі УМТП7. Контрастування зрізів проводили 1 % розчином уранілацетату і цитратом свинцю за Рейнольдсом (Б. Уіклі, 1975). Ультраструктурне дослідження проводили на мікроскопі ПЕМ 125К.
Результати досліджень статистично обробляли з використанням програми „STATISTICA 5.5” (належить ЦНІТ ВНМУ ім. М.І. Пирогова, ліцензійний № AXXR910A374605FA) і математично-статистичного пакету „Microsoft Offise Excel – 2003”. Для кожного з отриманих варіаційних рядів оцінювали характер розподілів, визначали середню арифметичну для кожної ознаки, її похибку та стандартне квадратичне відхилення. Достовірність різниці між незалежними порівнюваними величинами для малих виборок – за допомогою U-критерія Мана-Уітні, а для великих виборок при нормальному розподілі визначали за допомогою критерія Стьюдента (t).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Морфофункціональний стан головного мозку інтактних тварин.
Отримані дані показали, що всі досліджувальні показники інтактної групи тварин знаходяться в межах фізіологічної норми. Коливання маси тіла інтактних кролів було незначним, в межах нормального фізіологічного росту - 4,14±0,37 до 4,87±0,41 кг. Тварини були активними, мали густий та блискучий шерстяний покрив, добрий апетит.
Біохімічним дослідженням ліпідного ліпідного спектру сироватки крові тварин встановлено, що вміст ЗХ знаходяться в межах 0,85±0,06 - 0,88±0,09 мМ/л; ЛПНЩ - 1,35±0,12 - 1,48±0,16 г/л; ЛПВЩ – 6,08±0,90 - 6,33±0,83 мМ/л; ТГ – 0,51±0,20 - 1,00±0,25 мкМ/л; ФЛ – 0,97±0,15 - 1,08±0,21 г/л; ІА – 0,82±0,17 - 0,91±0,18.
О
б’ємна швидкость мозкового кровотоку (ОШМК) у внутрішніх сонних артеріях, основною функцією яких є транспорт крові до мозку, в тварин інтактної групи знижується повільно з 17,56±0,29 до 12,62±0,22 % протягом 30 хв. дослідження (рис. 1).
Рис.1. Динаміка об’ємної швидкості мозкового кровотоку при ЕДЛП та її фармакокорекції.
Макроморфометричними вимірами параметрів головного мозку інтактних тварин було встановлено, що маса головного мозку кролів становить 13,000,71 г, об’єм головного мозку - 12,500,78 г/мг. Параметри довжини головного мозку складають - 44,603,44мм, довжина півкуль - 30,000,71мм. Висота мозку - 17,001,22мм, ширина мозку - 33,001,58 мм.
При мікроморфометричному дослідженні артерій малого калібру м’якої мозкової оболонки інтактної групи тварин було встановлено, що зовнішній їх діаметр становить 42,89±1,66 мкм, внутрішній – 23,99±0,51 мкм, товщина стінки – 9,44±0,61 мкм. Площа поперечного перерізу артерій малого калібру м’якої мозкової оболонки становить 472,67±36,86 мкм2, площа просвіту – 155,97±6,62 мкм2, площа стінки – 316,69±32,35 мкм2 (табл. 1).
Таблиця 1
Морфометричні параметри артерій малого калібру м’якої мозкової оболонки при ЕДЛП та її фармакокорекції (М±m).
| Показник | Групи тварин | ||||
| Інтактна | ЕДЛП | Вінборон | Пентоксифілін | Вінпоцетін | |
| Площа перерізу (мкм2) | 472,67± 36,85 | 786,48± 21,72 * | 536,03± 15,69*/** | 650,97 ±32,08*/** | 607,03± 40,76*/** |
| Зовнішній діаметр (мкм) | 42,89± 1,66 | 47,05± 0,53 * | 43,86± 0,57*/** | 45,58± 0,38*/** | 43,38± 0,57*/** |
| Внутрішній діаметр (мкм) | 23,99± 0,51 | 16,04± 0,95 * | 22,71± 1,24*/** | 18,07± 2,14* | 19,93± 0,85*/** |
| Площа просвіту (мкм2) | 155,97± 6,62 | 107,76± 0,84 * | 131,15± 1,59*/** | 123,82± 2,28*/** | 127,40± 1,26*/** |
| Площа стінки (мкм2) | 316,69± 32,35 | 677,07± 22,10 * | 404,88± 16,54*/** | 529,67± 30,25*/** | 479,62± 39,54*/** |
| Товщина стінки (мкм) | 9,44±0,61 | 15,50±0,54 * | 10,57± 0,83*/** | 13,24± 1,05*/** | 11,72± 0,53*/** |
| Індекс Вогенворта (%) | 206,57± 20,75 | 628,93± 17,81 * | 317,53± 15,59*/** | 427,67± 21,07*/** | 371,62± 26,65*/** |
Примітка. * - різниця достовірна порівняно з інтактною групою (р≤0,01);
** - різниця достовірна порівняно з групою ЕДЛП (р≤0,01).
При гістохімічному дослідженні в стінці артерій м’якої мозкової оболонки та капілярах кори головного мозку ліпіди не виявляються. Наявність ліпідів спостерігається у вигляді дрібних крапель та напилення в нервових клітинах кори головного мозку.
Результати морфологічного світлооптичного дослідження кори головного мозку інтактних тварин показали, що м’яка мозкова оболонка, яка вкриває кору головного мозку, містить дрібні артерії, від яких в кору розгалужуються багаточисельні капіляри. В корі великого мозку кролів під м’якою мозковою оболонкою спостерігаються такі структурні компоненти: тіла клітин з відростками, їх ядра, ядерця; капіляри. Розрізняються тіла нейронів і тіла нейроглії. Нейрони утворюють в корі головного мозку шість шарів: І – молекулярний, ІІ – зовнішній зернистий, ІІІ – зовнішній пірамідний, ІV – внутрішній зернистий, V – внутрішній пірамідний (гангліонарний), VІ – шар поліморфних клітин.
За характерними особливостями цитоплазми і ядер, а саме вмістом і розподілом в ній тигроїду (гранул хроматофільної субстанції) пірамідні нейрони кори головного мозку поділяються на різні типи: нормохромні, гірохромні, різко гіпохромні, гіперхромні, різко гіперхромні та клітини „тіні”. Результатами визначення вмісту різних типів нейронів, що відображають морфофункціональний стан цих клітин встановлено, що у інтактної групи тварин в ІІІ і V шарах переважають нормохромні (86,61±1,37 %) і невеликий відсоток гіпо- та гіперхромних нейронів. Нормохромні нейрони мають середню інтенсивність забарвлення цитоплазми і рівномірно розподілені в ній гранули хроматофільної субстанції. Ядра таких нейронів, в порівнянні з цитоплазмою, більш світлі, ядерця центрально розміщені або дещо зміщені до ядерної оболонки. Гіпохромні нейрони – частіше з периферичним хроматолізом. Гіперхромні нервові клітини мають темну базофільну цитоплазму та каріоплазму, тому ядра і ядерця погано виявляються. В тварин інтактної групи пірамідні нейрони мають добре виражене клітинне тіло, об’єм якого складає в середньому 3270,11±165,36 мкм3. Цитоплазма заповнена дрібнозернистим тигроїдом. Об’єм цитоплазми - 1786,99 ± 0,13 мкм3. Округлі або овальні ядра мають чітку оболонку та містять одне, рідше два темних ядерця. Об’єм ядер становить - 1483,12 ± 3,51 мкм3, ядерець - 26,42±0,03 мкм3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
