92281 (680555), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Використовувались наступні спеціальні методи фарбування: забарвлення гематоксиліном та пікрофуксіном (за Ван-Гізоном), сріблення за Гоморі, забарвлення тіоніном за Нісселем. Визначення проліферативної активності пухлинних клітин здійснювалось шляхом виявлення нуклеопротеїну Кі-67 непрямим імуногістохімічним пероксидазним (DAB) методом.
Для цитологічного та цитогенетичного дослідження готувалися препарати-відбитки пухлинної тканини з нефіксованого біоптичного матеріалу. Цитологічні препарати фарбувались за Папенгеймом і паралельно гематоксиліном та еозином. Для виявлення ядерцевих організаторів та клітин в стані апоптозу використовувався метод сріблення за Хоуел-Блеком з додатковим електронно-мікроскопічним дослідженням ультраструктурних особливостей клітин визначених цитоморфологічних типів.
Для кількісної оцінки структурних ознак використовувався апаратно-програмний комплекс для морфологічних досліджень клітин у складі: мікроскоп біологічний, цифрова камера та програмний модуль для обробки і аналізу цифрових зображень клітин виробництва фірми “Leica Microsystems CMS GmbH”, (Німеччина). Дослідження проводилось в 20 репрезентативних полях зору зі стандартною вимірною рамкою при збільшенні 400. Індекс мічення (ІМ) Кі-67 розраховувався як відношення числа позитивно забарвлених ядер на 100 клітин. Апоптозний індекс (АІ) визначався шляхом підрахунку кількості апоптозних тілець та його еквівалентів на 1000 клітин препарату-відбитка срібленого за методом Хоуел-Блека (20 полів зору по 50 клітин). При аналізі ядерцевих організаторів, відповідно до класифікації П.В. Челідзе, О.В. Зацепіна (1988), підраховувались всі зерна срібла, які окремо розпізнавались, як в самих ядерцях, так і в ядрах в 400 клітинах кожного препарату (10 полів зору по 40 клітин),
Статистична обробка проводилась з використанням пакета програм Statistica 5.0.
Результати досліджень. В результаті вивчення топографо-анатомічних характеристик росту МБ мозочка було встановлено, що як у дітей, так і у дорослих, ці пухлини характеризуються інвазивним поширенням. Частка Т3-Т4 стадій за Сhang (1969) становила 92,8%, інфільтрація дна IV шлуночка спостерігалася у 40,5% випадків МБ черв’яка мозочка у дітей та у 66,6% у дорослих пацієнтів. У дитячому віці відмічалось більш поверхневе розташування пухлини у порожнині IV шлуночка з ростом по поверхні епендимарного покриву з наступним розповсюдженням у ділянку центрального каналу, у дорослих пацієнтів спостерігалась більш виразна інфільтрація дна IV шлуночка та частіше мало місце поширення пухлини на вентральну поверхню стовбуру мозку – 15,4%, що майже в два рази перевищує подібні показники у дітей.
Ми встановили, що розподіл МБ за структурними підтипами відрізнявся в різних вікових групах. Виявилось, що у пацієнтів 18-48 років, МБ “класичної” будови значно переважали над іншими підтипами цих пухлин та становили 61,5% від усіх спостережень в цій групі, частка пухлин цього підтипу у пацієнтів віком до 18 років – 33%. Дрібноклітинні малодиференційовані МБ становили другий за чисельністю підтип МБ, як у дорослих, так як і у пацієнтів дитячого віку (12,8% та 25,7% відповідно). Пухлини з варіантами епендимарного та гліального диференціювання у дорослих зустрічались нечасто (7,7% та 2,6% відповідно). На відміну, у дітей ці підтипи були представлені серед більшого числа спостережень (17,5% та 12,4%). Виключення становили лише випадки МБ із здатністю до нейронального визрівання – у старших пацієнтів вони зустрічались частіше (7,7%), чим у дітей (2,1%). Тобто, з перерахованого можна зробити висновки, що тенденція до клітинного диференціювання виразніша в молодшому віці.
Медулобластоми, як відомо, виявляють тенденцію до субарахноідальної дисемінації пухлинних елементів з формуванням імплантаційних метастазів. На момент первинної діагностики дисемінація процесу підтверджується у 22,1% усіх випадків (це 23,7% пацієнтів до 18 років та 18% – дорослих).
У різні строки після першої операції у 30,1% від усіх спостережень виявлялись ознаки продовженого росту МБ та/чи метастатичне ураження (24,7% серед випадків дитячих МБ та 42,6% з групи дорослих пацієнтів). Час від першої операції до моменту виявлення продовженого росту та/чи метастазів у дітей становив від 2,5 місяців до 3,5 років (M±m 16,9±2,3 місяці), а у дорослих пацієнтів від 6 місяців до 14 років (M±m 42±11,7 місяці) відповідно. У пацієнтів дитячого віку частота метастазування (14,4%) була вище ніж відсоток продовженого росту (11,3%), навпаки, в групі дорослих пацієнтів ризик продовженого росту пухлини (38%) значно переважає над часткою метастатичного ураження (17,2%).
Проведені дослідження морфологічних змін у пухлинній тканині метастазів МБ та при продовженому рості, порівняно з матеріалом первинних пухлин, дали змогу виявити певні чіткі закономірності. Насамперед це стосується трансформації типової гістоархітектоніки, внаслідок чого зменшується кількість патогномонічних для МБ “класичної” структури псевдорозеток Хомера-Райта та колонарних структур, вони стають менш чіткими, “змазаними”. Розташування пухлинних елементів втрачає свою періодичність та відносну рівномірність, характерну для первинних МБ, замість цього визначаються вогнищеві густоклітинні скупчення, які межують з більш пухкими ділянками, серед яких розсіяні окремі злоякісні клітини. Вказані зміни виявлялись не лише в “класичних” МБ. В усіх варіантах, які в тій чи іншій мірі були здатні до різних типів клітинного диференціювання, виникала певна тенденція до зменшення ступеня “зрілості”, тобто гістотип МБ, в умовах рецидиву хвороби, наближався до дрібноклітинного малодиференційованого. Такі зміни ми вважаємо специфічними проявами пухлинної прогресії, на відміну від інших знахідок, як то – вогнища некрозів з появою багатоядерних клітин, сполучнотканинна активація у оболонах мозку, дегенеративні зміни стінок судин з проявами порушення мікроциркуляції. Останні можуть свідчити як про реактивні процеси в тканинах прилеглих до зони інвазії, так і у випадках продовженого росту можуть бути наслідком впливу променевої терапії.
За нашими даними кількість мітозів у різних зразках пухлинної тканини значно коливалась. На матеріалі перших операцій середнє значення мітотичного індексу (МІ) становило (M±m 0,410,07%). Крива розподілу частот в залежності від значення МІ мала двохфазний характер, на основі чого всі досліджені зразки були розподілені на дві неоднорідні групи: з низькими та більш високими показниками мітотичної активності. У 11% випадків МБ мали дуже низькі показники мітозу, 50% – показували значення мітотичного індексу близькі до вказаного середнього, для решти 29% МБ – значення МІ коливались від 0,33% до 1,2%, з максимумом частоти при значенні МІ=0,78%, та суттєво не відрізнялись в різних вікових групах. У випадках продовженого росту на матеріалі повторних операцій МІ дещо зростав (M±m 0,580,06%), але різниця не була достовірна (р>0,05).
Експресія ядерного антигена Кі-67 спостерігалась в усіх досліджених зразках. Для того, щоб виявити можливі коливання індексу мічення (ІМ) Кі-67 було виділено кілька груп: до першої були включені пацієнти з тривалістю безрецидивного виживання (БРВ) більше 12 місяців, до другої випадки продовженого росту, третю групу складали метастази. Всі ці випадки співставлялись з матеріалом першої операції та досліджувались в динаміці. Значення ІМ Кі-67 в МБ у пацієнтів з БВ >12 місяців коливались від 14,7% до 34,2% (M±m 24,66±1,5%). У другій дослідній групі з випадками продовженого росту МБ, коли паралельно досліджували матеріал першої та другої операцій, значення ІМ Кі-67 на матеріалі перших операцій становили від 17,9% до 42,3% (M±m 29,54±2,32%). Значення ІМ Кі-67 при продовженому рості коливались від 19,1% до 41,6% (M±m 31,34±1,8%). Тобто різниця в проліферативній активності первинних та рецидивних пухлин суттєво не відрізнялась та її показники мали близькі значення в різних вікових групах. Але при співставленні динаміки змін ІМ Кі-67 в індивідуальних спостереженнях МБ були виявлені хвилеподібні коливання проліферативної активності, як в один, так і в інший бік. Цей факт може свідчити, по-перше, що біологічні особливості росту МБ носять нелінійний характер, а по-друге це може бути обумовлене впливом протипухлинного лікування.
Порівняльний аналіз первинних та метастатичних пухлин виявив достовірну відмінність та особливості розподілу Кі-67 позитивних клітин в метастатичних вогнищах. Індекс мічення Кі-67 в первинних пухлинах цієї групи становив М±m 35,9±3,04%, а на матеріалі метастазів – М±m 21,88±1,97% (р<0,05). Розподіл Кі-67 позитивних клітин в зразках метастатичної пухлини був нерівномірний, власне пухлинний вузол найчастіше виявлявся негативним, чи демонстрував слабку експресію цього антигену. Найбільша активність спостерігалась в зонах інвазії пухлини, де різко позитивні клітини утворювали ланцюжки та вогнищеві скупчення. Також високі показники ІМ Кі-67 реєструвались навколо судин, в периадвентиціальних пухлинних комплексах.
Апоптозні ядра виявлялись, як в “класичних” МБ, так і в інших структурних підтипах цих пухлин, але найбільш високі показники апоптозного індексу (АІ) спостерігались при десмопластичному варіанті. Розподілення апоптозних ядер в МБ було, як правило, нерівномірне, вони частіше зустрічались в густоклітинних ділянках пухлини, а також навколо некротичних вогнищ. При дослідженні АІ спостереження розподілялись на декілька груп, за аналогією з тими, які виділялись для аналізу проліферативної активності.
Значення АІ в МБ у пацієнтів з БВ>2 місяців коливалось від 0,1% до 0,9% (M±m 0,41±0,06%). У другій групі значення АІ на матеріалі перших операцій коливалось від 0,4% до 1,2% (M±m 0,67±0,07%), а при продовженому рості АІ знаходився у інтервалі від 0,4% до 3,8% (M±m 1,18±0,24, р=0,05). Деяке підвищення рівня апоптозу при продовженому рості МБ можливо пов’язане з впливом опромінення та його некротизуючою дією на пухлинну тканину, що непрямо могло сприяти появі більшої кількості клітин в стані апоптозу навколо зон променевої деструкції.
За результатами співставлення матеріалу перших операцій з тканиною метастазів, які видалялись під час першої операції разом з основним пухлинним вузлом, або метастазів видалених з головного чи спинного мозку під час повторної операції була виявлена достовірна різниця (р=0,04). Апоптозний індекс в первинних пухлинах становив 2,74±0,77%, а в тканині метастазів – 6,41±1,06%, тобто в метастатичних вогнищах різко підвищувалась апоптотична активність.
З отриманих нами даних, коли порівнювався рівень апоптозу в групах, відмінних за показниками безрецидивного виживання та проявами прогресуючого перебігу, були виявлені чіткі статистично-вірогідні відмінності у пацієнтів з високим ризиком метастатичного ураження (р=0,001). Той факт, що дані результати були встановлені на матеріалі первинних пухлин, ще до призначення курсу комбінованого лікування, підтверджує вагу цього показника у прогнозуванні перебігу МБ. Тобто АІ вищий або рівний 1,5% можна вважати фактором ризику метастазування цих пухлин.
Аналіз морфологічної структури МБ виявив, що ці пухлини не тільки відрізняються між собою тканинною архітектонікою, але й неоднорідні за клітинним складом. Нами були описані чисельні клітинні форми, які входять до складу МБ. За сукупністю цитоморфологічних ознак та на підставі їх систематизації та морфометричного обчислення, нами були виділені за клітинним складом три варіанти (типи) МБ.
Перший тип – відносно однорідного складу, серед якого переважають клітини невеликого розміру 8-15 мкм з дрібним ядром округлої форми та чіткими контурами та слабо розвиненою, або зовсім невираженою цитоплазмою. Ці клітини вирізняються за структурою хроматину, переважно дрібноглибчастою з окремими грубими хроматиновими зернами та поодинокими компактними ядерцями з нечіткими контурами. В меншій кількості зустрічаються клітини з ядрами видовженої форми та не дуже чіткою ядерною мембраною з помірною кількістю зернистого та глибчастого хроматину.
Другий тип утворюють декілька клітинних форм, які при цьому не дуже відрізняються між собою за розміром та формою. Переважають одноманітні клітини, 8-12 мкм, з невеликим ядром і структурним ядерцевим утворенням та дрібні клітини, 7-11 мкм, з округлим ядром, багатим на хроматин, та слаборозвиненою цитоплазмою, які нагадують середній лімфоцит. Поряд з ними виявляються клітини видовженої форми з нормохромними ядрами.
Третій тип характеризується наявністю різко поліморфних клітин, розміри яких коливаються від 9 до 32 мкм. Переважно це клітини неправильної вугловатої форми з округлим гіпо- або нормохромним ядром, в якому визначаються компактні мікроядерця (від одного до п’яти) та клітини з ядрами порушеної конфігурації, з ознаками анізохромії та грубопетлистим розподілом хроматину. Часто виявлялись клітини в стані прямого мітотичного поділу. Знайдені клітинні форми були більш-менш густо розсіяні між більш типовими елементами МБ.
Використання високоспецифічної та в достатній мірі об’єктивної методики сріблення кислих негістонових білків дозволило не лише виявити ядерцеутворюючі регіони, але і визначити ступінь їх активності, який безпосередньо був пов’язаний зі структурою та функціональним станом клітин, які досліджуються. Вміст аргірофільних білків, які асоційовані з ділянками ядерцевих організаторів, був значно вище в МБ, порівняно з клітинами інтактного зернистого шару мозочка, який досліджувався в якості контрольного зразка та тканинами у нормі (p<0,05), що пов’язано з суперекспресією цих білків в клітинах з високим рівнем проліферації.
Серед низькодиференційованих пухлинних клітин, які входять до складу першого цитологічного типу, порівняно з контролем різко зростала кількість високоактивних компактних ядерець (M±m 0,87±0,11%), та в меншій мірі нуклеолонемних (M±m 0,50±0,1%); при цьому кількість кільцеподібних ядерець суттєво не змінювалась (M±m 0,24±0,1%), а вміст неактивних мікроядерець знижувався (M±m 0,21±0,01).
Другий цитологічний тип відрізнявся як більш високою загальною проліферативною активністю, так і показниками вмісту окремих ядерцевих форм, а саме – характерним збільшенням вмісту не лише компактних (M±m 3,95±1,24%), але і кільцевидних ядерець (M±m 1,12±0,54%).
Найвищі показники вмісту активних ядерцевих форм показували клітини, що були віднесені до третього цитологічного типу. Загальна кількість ядерцевих утворень у цьому випадку збільшувалась до (M±m 5,09±0,69%), компактних та нуклеолонемних – до 2,04±0,1% та 1,94±0,45% відповідно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
