92259 (680538), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Доведено можливість прямої дії естрадіолу на функцію кори надниркових залоз. Встановлено факт участі cAMP-залежної протеїнкінази А, протеїнкінази С, протеїнкіназ, що активуються мітогенами (ERK1/2), та ядерного фактора транскрипції с-fos у внутрішньоклітинному перенесенні регуляторного сигналу естрадіолу в адренокортикоцитах.
Встановлено стероїдогенний ефект N-ацильованих етаноламінів у корі надниркових залоз, що дозволяє віднести їх до нового класу адреномодуляторів.
Підтверджена участь протеїнкінази С у К+-залежній стимуляції стероїдогенезу в адренокортикоцитах.
Встановлено, що процес транслокації основної ізоформи протеїнкінази С, α-ізоформи, з цитозольної до мікросомної фракції адренокортикоцитів значно посилюється в пухлинах кори надниркових залоз. Вперше встановлено особливості експресії всіх відомих Са2+-незалежних ізоформ протеїнкінази С в субклітинних фракціях адренокортикоцитів людини, а також експресію рецепторної тирозинкінази RET в карциномах кори надниркових залоз людини.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведеної роботи доводять участь низки первинних месенджерів в регуляції стероїдогенезу, процесів росту та трансформації в клітинах кори надниркових залоз. Отримані дані можуть бути використані в розробці нових підходів до корекції трофічних та функціональних процесів в надниркових залозах за умов патології. Встановлене посилення апоптозу в адренокортикальній тканині під впливом інгібітору протеїнкінази С – хелеритрину, відкриває нові можливості пошуку і розробки засобів для лікування новоутворень надниркових залоз, скеровані на конкретні сигнальні мішені. Встановлене посилення транслокації α-ізоформи протеїнкінази С до мікросомної фракції адренокортикальних клітин пухлин та надекспресія рецепторних тирозинкіназ в карциномах кори надниркових залоз може використовуватись для розробки додаткових методів діагностики та прогнозування перебігу патологічних станів кори надниркових залоз людини.
Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Робота виконана автором відповідно до програми наукових досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1991-2007 рр. в лабораторії гормональної регуляції обміну речовин Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, здійснено пошук та аналіз літературних джерел, розроблено методичні підходи. Текст дисертаційної роботи написано здобувачем особисто. Головні завдання роботи, а також основні наукові положення дисертації і висновки сформульовано разом з науковим консультантом – членом-кореспондентом НАН та АМН України, д.мед.н., проф. М.Д. Троньком. Співучасть співробітників відділу патофізіології у виконанні роботи відображено у спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Головні положення дисертаційної роботи було представлено на І науково-практичній конференції молодих вчених-ендокринологів в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (Київ, 2001), VI, VIІ З’їздах ендокринологів України (Київ, 2001; 2007), VIІ, VIІІ, IX Українських біохімічних з’їздах (Київ, 1997; Чернівці, 2002; Харків, 2006), V, VI конференціях імені Я. Парнаса (Київ, 2005; Краків, Польща, 2007), ІV Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004), міжнародній науково-практичній конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної і клінічної медицини” (Тернопіль, 2004), V Всеросійському конгресі ендокринологів (Москва, Російська Федерація, 2006), 2-му з’їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007), засіданні Наукової ради з теоретичної та профілактичної медицини при Президії АМН України (Київ, 27 вересня 2007).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 36 робіт, з яких 1 колективна монографія, 21 стаття у фахових наукових журналах, 14 тез доповідей у матеріалах наукових з’їздів та конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 299 сторінках друкованого тексту. Робота складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4 розділів результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який налічує 534 посилання. Текст дисертації проілюстровано 51 рисунком та 13 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано сучасні дані стосовно механізмів регуляції стероїдогенезу кортикотропіном та ангіотензином II, іншими потенційними модуляторами адренокортикальної функції. Зроблено акцент на фактах, які свідчать про існування нових механізмів контролю гормонопоезу агоністами, таких що доповнюють загальноприйняту схему регуляції або суперечать їй.
Матеріали і методи досліджень. Більшість досліджень проведено на тканинах пухлин надниркових залоз хворих з такою патологією: аденома кори надниркових залоз (гормонально-неактивна (28 зразків), гормонально-активна: кортикостерома (29 зразків), альдостерома (12 зразків), андростерома (3 зразки)), карцинома кори надниркових залоз (11 зразків), хвороба Іценка-Кушинга (24 зразки). Були досліджені також ділянки візуально незміненої тканини кори надниркових залоз (умовно нормальна тканина), всього 71 зразок. В дослідах використовували післяопераційні тканини надниркових залоз хворих, прооперованих у клініці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України. В роботі також були використані експериментальні тварини (всього 305) – самки та самці (інтактні та орхіектомовані) щурів лінії Вістар масою 200-250 г, самці морських свинок масою 350-550 г, тканина надниркових залоз новонароджених поросят.
Для вивчення стероїдогенезу зрізи кори надниркових залоз щурів інкубували з 3Н-холестерином ("Ізотоп", Російська Федерація). Екстраговані стероїди розділяли методом двомірної тонкошарової хроматографії на силікагелі КСК [Челнакова и др., 1990], визначали радіоактивність продуктів мічення.
Для характеристики метаболізму фосфатидилхоліну до контрольних та дослідних суспензій клітин кори надниркових залоз морських свинок додавали 3Н-холін ("Amersham", Велика Британія). Екстракцію ліпідів проводили за методом [Bligh, Dyer, 1959]. Фосфоліпіди розділяли мікротонкошаровоїю хроматографією в системі розчинників: хлороформ : метанол : 28 % аміак (65 : 35 : 5) (1-й напрямок) та хлороформ : ацетон : метанол : оцтова кислота : вода (30 : 40 : 10 : 10 : 5) (2-й напрямок). Водорозчинні метаболіти фосфатидилхоліну розділяли тонкошаровою хроматографією на силікагелі Н ("Merck", Німеччина) в системі розчинників: метанол : 2,4 % NaCl : вода : 28 % аміак (50 : 12,5 : 37,5 : 5). Перед хроматографією до проб додавали аутентичні немічені свідки ("Sigma", США).
АКТГ та пролактин йодували хлораміновим методом [Чард, 1981]. Як ліганд для вивчення зв’язування АКТГ використовували також (3-[125I]йодотирозил23)АКТГ(1-39) ("Amersham", Велика Британія). Стандартна проба для вивчення рецепції містила мічений гормон (100 000 імп./хв), 50-100 мкг білка мікросом або 105-106 клітин. Для визначення неспецифічного зв’язування до проби додатково вносили по 10 мкг/мл неміченого АКТГ або пролактину, а для визначення загального зв’язування – тільки мічений гормон.
Субклітинні фракції адренокортикоцитів отримували методом диференційного ультрацентрифугування з додатковою очисткою ядерної фракції у градієнті щільності сахарози [Buckley et al., 1988].
Визначення активності протеїнкінази С (ПКС) у субклітинних фракціях клітин кори надниркових залоз людини або щурів проводили з використанням нейрограніну – високоспецифічного лужного пептидного субстрату ПКС, який внаслідок фосфорилювання ПКС змінює заряд та рухається в агарозному гелі до аноду [Uchida et al., 2000], а нефосфорильований нейрогранін, використаний як негативний контроль, мігрує до катоду. Інкубаційне середовище для визначення активності ПКС містило трис-HCl буфер, Mg-ацетат, АТР, а також специфічні активатори ферменту (Са2+, фосфатидилсерин), нейрогранін та білки досліджуваних субклітинних фракцій.
Специфічну активність протеїнкінази А (ПКА) визначали за методикою, що базується на зміні напрямку руху в агарозному гелі пептидного субстрату кемптиду внаслідок його фосфорилювання ПКА [Kemp et al., 1977]. Інкубаційне середовище для визначення активності ПКА містило трис-HCl буфер, АТР, активатори ферменту (Mg2+, cAMP), кемптид та білки субклітинних фракцій.
Рівень cAMP та cGMP визначали, використовуючи радіоімунологічні набори TRK-432 та -500 відповідно ("Amersham", Велика Британія).
Детекцію ізоформ ПКС, каспази-3, протеїнкіназ, що активуються мітогенами, факторів транскрипції проводили імуноблот-аналізом із використанням моноклональних антитіл [Kurien, Scofield, 2006]. Розділені методом електрофорезу у поліакриламідному гелі за присутності додецилсульфату натрію білки [Laemmli, 1970] переносили на нітроцелюлозну мембрану напівсухим способом. Після інкубації з первинними і вторинними антитілами імунні комплекси візуалізували за допомогою реагенту ECL. Після денситометричного визначення інтенсивності засвічення плівки Hyperfilm ECL результати обробляли у програмі "PhotoCaptMw".
Екстракцію ДНК із зрізів проводили, послідовно інкубуючи адренокортикальну тканину з протеїназою К та рибонуклеазою А [Kostyuchenko et al., 2005]. Депротеїнізацію проводили сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (24 : 1). ДНК осаджували з водної фази етанолом. Екстракцію РНК проводили, використовуючи реагент TRIzol LS ("Invitrogen", США).
Реакцію зворотної транскрипції проводили в реакційній суміші, що містила: стандартний буфер для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), хлористий магній, суміш дНТФ, а саме АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ, інгібітор РНКази, зворотну транскриптазу, суміш випадкових гексамерів та 1 мкг екстрагованої РНК. Інкубація в термоциклері проводилась за таких умов: 22 0С – 10 хв, 42 0С – 15 хв, 99 0С – 5 хв, 4 0С – 5 хв.
Реакцію ПЛР проводили в суміші, що містила: стандартний буфер для ПЛР, хлористий магній, дНТФ, полімеразу red hot taq, прямий та зворотній праймери до RET тирозинкінази (РТК), комплементарну ДНК, одержану в результаті реакції зворотної транскрипції. Умови інкубації: 95 оС – 30 сек, 50 оС – 30 сек, 72 оС – 1 хв, а потім температуру знижували до 4 оС. Кількість циклів становила 30. Продукти ПЛР аналізували в 1,7 % агарозному гелі.
Впродовж всієї роботи використовували кортикотропін А ("Sigma", США),17-естрадіол, естрадіол бензоат ("Кoch-Ligth", Велика Британія), пролактин великої рогатої худоби (Каунаський завод ендокринних препаратів, Литва). NAE (суміш N-ацилетаноламінів, N-стеароїлетаноламін) було синтезовано в Інституті біології моря (Владивосток, Російська Федерація). о,п’-ДДД було синтезовано в лабораторії оргсинтезу та хімреактивів Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України.
У роботі були використані моноклональні антитіла до ізоформ протеїнкінази С-α, -β1, -β2, -γ, -δ, -ε, -η, -θ, -µ -ζ; οротеїнкіназ, що активуються мітогенами – ERK1/2, JNK, p38; факторів транскрипції – с-jun, с-fos; каспази-3 ("Cell Signaling Technology" або "Sigma", США); IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону ("Sigma", США), субстрати нейрогранін та кемптид (Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys та Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly відповідно, "Sigma", США) нітроцелюлозна мембрана Hybond C та реагенти для посиленої хемілюмінесценції ("Amersham Life Science", Велика Британія), набори для проведення полімеразної ланцюгової реакції ("Roche", Франція), агароза, трис, протеїназа К, рибонуклеаза А ("Sigma", США), колагеназа ("Fluka", Швейцарія), усі солі, NaOH, HCl ("Merck", Німеччина).
Для характеристики генеральної сукупності вираховували середнє значення М та середню похибку m, які представлено у ілюстративному матеріалі. Різницю між двома вибірками визначали за параметричним t-критерієм Стьюдента, непараметричним U-критерієм Вілкоксона-Манна-Уїтні та дисперсійним аналізом за F-критерієм Фішера.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Дослідження месенджерних систем, що опосередковують сигнали актг в адренокортикальних клітинах. Регуляція кортикотропіном адренокортикальної функції забезпечується здебільшого за рахунок прямого фосфорилювання cAMP-залежною ПКА специфічних білків, а також стероїдогенних факторів, що беруть участь в реакціях стероїдогенезу, змінюючи його швидкість. Не викликає сумнівів, що cAMP/ПКА-залежна месенджерна система не є єдиною системою опосередкування дії АКТГ в клітині. Гормон здатний активувати різні протеїнкінази, проте інші сигнальні каскади, залучені до перенесення сигналів АКТГ, досліджені значно менше, ніж cAMP/ПКА-залежний. Особливу увагу дослідників в цьому аспекті привернула протеїнкіназа С. Відомо, що деякі протеїни можуть одночасно бути субстратами для кількох кіназ, що є важливим загальним принципом інтеграції пострецепторних сигналів в клітині. Це істотно ускладнює розуміння механізмів опосередкування регуляторних сигналів АКТГ та можливої взаємодії між різними месенджерними системами. Потрібно також зазначити, що механізми дії АКТГ досліджувались раніше здебільшого на лініях пухлинних клітин надниркових залоз, спробу оцінки дії гормону на умовно нормальних тканинах надниркових залоз людини ми провели вперше.
Участь цAMФ-залежної ПКА та серин/треонінової протеїнкінази С в реалізації ефектів АКТГ. На початку досліджень необхідним було з’ясування специфіки механізмів перенесення регуляторного сигналу АКТГ в корі надниркових залоз людини із залученням цAMФ-залежної ПКА та серин/треонінової ПКС. В дослідах використовували післяопераційні умовно нормальні тканини надниркових залоз хворих, прооперованих у клініці Інституту. АКТГ in vitro у концентрації 0,2 од./100 мг тканини не призводить до активації ПКА та ПКС ні в мембранній, ні в цитозольній фракціях. При збільшенні концентрації кортикотропіну до 2 од./100 мг тканини протеїнкіназна активність у мікросомній фракції зростає у 4,5 рази порівняно з контрольними пробами у випадку ПКА та у 1,4 рази у випадку ПКС. Визначення розподілу ізоформи ПКС- в субклітинних фракціях клітин після інкубації у середовищі з різним вмістом АКТГ за допомогою імуноблот-аналізу показало, що із збільшенням концентрації кортикотропіну кількість ферменту зростала в ядерній фракції (рис. 1), не змінюючись ні в мікросомній, ні в цитозольній фракціях адренокортикоцитів. Отже, суттєва роль у трансдукції сигналу кортикотропіну в адренокортикальних клітинах людини може належати не тільки мембранозв’язаній формі ПКС, але і ядерній ПКС.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
