92246 (680530), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Здобувачем особисто розроблено стратегію пошуку в рослинній сировині сполук нового спрямування дії – модифікаторів антибіотикорезистентності бактерій. Самостійно виконано дослідження синергізму протимікробної дії рослинних екстрактів і класичних антибіотиків відносно резистентних штамів стафілококів. Особисто вивчено вплив рослинних екстрактів на динаміку росту мікробних культур та адгезивні властивості стафілококів. Дослідження здатності рослинних екстрактів індукувати продукцію ендогенного IFN і TNF- виконано за участю канд. мед. наук Н.М. Жолобак у відділі інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (зав. – докт. біол. наук., засл. діяч науки і техніки України, чл. -кор. НАН України, проф. М.Я. Співак).
Токсикологічні експерименти виконано за участю І.О. Нектєгаєва (Львівський Національний медичний університет ім. Д. Галицького) і проф. С.Б. Геращенка (Івано-Франківський державний медичний університет).
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки та практичні рекомендації дисертації доповідались і обговорювались на ІX і Х з’їздах Товариства мікробіологів України (Чернігів, 2000; Одеса, 2004), 2-му з’їзді фтизіатрів і пульмонологів України (Київ, 1998), VІІ і VІІІ ювілейному з’їздах Всеукраїнського лікарського товариства (Тернопіль, 2003; Івано-Франківськ, 2005), VII, ІХ і Х Конгресах Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (Львів, Трускавець, 2000; Луганськ, 2002; Чернівці, 2004), на V Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених, приуроченому до 10-ї річниці незалежності України (Тернопіль, 2001), міжнародних конференціях пам’яті Р. Вейгля International Weigl Conference "Microorganisms in Pathogenesis and their Drug Resistance" (Lviv, 2003), "Chemistry of Nitrogen Containing Heterocycles" (Kharkiv, 2003), "Новые технологии получения и применения биологически активных веществ" (Алушта, 2002), "Оздоровчі ресурси Карпат і прилеглих регіонів" (Чернівці, 1999), міжнародних науково-практичних конференціях "Лекарства – человеку" (Харків, 2000), "Пробіотики – ХХІ століття: Біологія. Медицина. Практика" (Тернопіль, 2004), IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології "Актуальні питання фармакології" (Вінниця, 2004), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю "Сучасні досягнення фармацевтичної науки та практики" (Запоріжжя, 2006), XXІ Українській конференції з органічної хімії (Чернігів, 2007), науково-практичних конференціях з міжнародною участю "Сепсис: Проблеми діагностики, терапії та профілактики" (Харків, 2006), "Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів" (Тернопіль, 2006), "Сучасний стан і актуальні проблеми ортопедичної стоматології" (Івано-Франківськ, 2005), регіональній науково-практичній конференції "Антибіотикотерапія у внутрішній медицині і хірургії" (Івано-Франківськ, 2006), на Всеукраїнському науково-практичному семінарі "Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії" (Харків, 2004), 9-ій науковій конференції "Львівські хімічні читання – 2003" (Львів, 2003), науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження проф. Калини Георгія Платоновича "Розвиток санітарної мікробіології в Україні" (Чернівці, 2002), на науковій конференції, присвяченій 50-й річниці з часу заснування Івано-Франківської державної медичної академії (Івано-Франківськ, 1995), на підсумкових наукових конференціях Івано-Франківського державного медичного університету (1998, 2003, 2007), на засіданнях Івано-Франківського обласного товариства мікробіологів і епідеміологів.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 76 наукових робіт, серед них 37 статей у фахових наукових журналах і збірниках, рекомендованих ВАК України для публікації результатів дисертаційних досліджень, отримано 6 патентів України на корисні моделі і винаходи (і 1 позитивне рішення за заявкою на винахід), підготовлено до друку монографію.
Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 319 сторінках комп’ютерного тексту, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, 7 розділів власних досліджень з 40 рисунками і 63 таблицями, розділ аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновки, практичні рекомендації, список використаної літератури, який налічує 494 джерела (85 кирилицею і 409 латиною), а також 14 додатків, викладених у окремому томі на 289 сторінках.
Основний зміст роботи
У вступі проаналізовано фактори, які сприяють формуванню і поширенню поліантибіотикорезистентних штамів стафілококів у сучасних умовах. Наголошується на відсутності у вітчизняних лікувальних закладах систем мікробіологічного моніторингу та протиінфекційного контролю, що призводить до порушення основних принципів застосування протимікробних препаратів. Обгрунтовано актуальність теми дисертаційного дослідження, викладено мету та завдання, які розв’язувались при його виконанні. Визначено зв’язок роботи з державними науковими програмами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, наведено дані щодо апробації дослідження, вказано обсяг і структуру дисертації.
У першому розділі подано огляд літератури, в якому стисло викладено проблему глобального поширення у світі MRSA і MR-CNS, охарактеризовано їх роль у виникненні опортуністичних та нозокоміальних інфекцій в сучасних умовах. Акцентовано увагу на механізмах метіцилінрезистентності стафілококів та їх асоційованої резистентності до антибіотиків інших груп, синтетичних хіміотерапевтичних засобів, антисептиків, дезинфектантів. Крім того, критично проаналізовано сучасні засоби і підходи до лікування інфекцій, спричинених MRS.
У другому розділі охарактеризовано матеріали, методи та обсяг виконаних досліджень. Із 1990 р. виконується постійний моніторинг за характером мікрофлори, що виділяється від пацієнтів у лікувальних закладах різного профілю м. Івано-Франківська і області. На основі комп’ютерної програми WHONET 5.1 (http: // www. who. int/drugresistance/whonetsoftware/en/) створена постійно поповнювана база даних, яка містить результати мікробіологічного дослідження різних видів клінічного матеріалу (включаючи антибіотикограми збудників) з докладною інформацією про відповідних пацієнтів. Проаналізовано результати вивчення чутливості до антибіотиків різних груп 9980 ізолятів стафілококів (4271 штамів, або 42,80% S. aureus і 5709 штамів, або 57, 20% CNS), виділених на Прикарпатті в 1990-2006 рр., досліджено епідеміологічні аспекти поширення MRS.
Для поглибленого мікробіологічного дослідження з визначенням профілів та детермінант антибіотикорезистентності відібрано 530 штамів стафілококів клінічного походження (в тому числі 204 штами S. aureus і 326 штамів CNS), які ідентифікували відповідно до рекомендацій 12-го видання "Визначника бактерій Берджі" за комплексом культуральних і біохімічних властивостей ("STAPHYtest 16", Lachema, Чехія). Крім того, в роботі використано 17 колекційних штамів стафілококів з Музею патогенних мікроорганізмів ДУ "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМНУ" (м. Харків). Чутливість клінічних і колекційних ізолятів до антибіотиків визначали дискодифузійним методом на середовищі Мюллера–Хінтона з 4% хлориду натрію згідно з рекомендаціями Національного комітету клініко-лабораторних стандартів (NCCLS) США (1999), а також методами серійних розведень в агарі (Красильников А.П., 1995) та бульйоні (Thornsberry C. etc., 1983).
Ідентифікацію метіцилінрезистентних штамів стафілококів здійснювали на основі визначення чутливості до оксациліну методом двократних серійних розведень в сольовому агарі Мюллера–Хінтона та виявлення пеніцилін-зв’язуючого білка PBP2ў (продукту гена mecA) методом латекс-аглютинації (Slidex® MRSA Detection, bioMerieux, Франція). Ідентифікацію ефлюксного механізму резистентності до фторхінолонів здійснювали на основі зміни чутливості ізолятів до ципрофлоксацину в присутності специфічних інгібіторів помпи NorA – 20 мкг/мл резерпіну (Gibbons S. etc., 2003) і 25 мкМ верапамілу (Ince D. і Hooper D. C., 2001). Ефлюксний механізм резистентності стафілококів до макролідів (помпа MsrA) виявляли за зміною чутливості штамів до еритроміцину в присутності суббактеріостатичної концентрації (0,5 мкМ/мл) арсенату натрію (Wondrack L. etc., 1996). Крім того, вивчали чутливість клінічних ізолятів стафілококів до тетрацикліну в присутності 30 мкг/мл резерпіну – неспецифічного інгібітора помпи TetK (Gibbons S. і Udo E. E., 2000; Gibbons S. etc., 2003). Протимікробні концентрації антибіотиків та їх комбінацій з відомими інгібіторами ефлюксних механізмів резистентності визначали мікрометодом серійних розведень в бульйоні (Thornsberry C. etc., 1983).
Виконано первинний мікробіологічний скринінг 316 нових синтетичних гетероциклічних сполук (похідних тіазолідину, тіазолу, фурану, хіноліну та акридину) і 359 рослинних екстрактів (з них 203 водно-етанольні, 156 – органічні) різних органів 155 культивованих і дикоростучих лікарських рослин флори України. Скринінгові дослідження виконано за допомогою розробленої мікромодифікації методу дифузії в агар. Активні препарати досліджено методами серійних розведень в агарі та бульйоні з використанням сформованих тестувальних панелей колекційних і клінічних штамів стафілококів. З метою оцінки і порівняльного аналізу протистафілококової активності препаратів визначали їх ефективні діючі концентрації для груп штамів, сформованих в межах загальної вибірки за ознаками видової належності та антибіотикорезистентності: МБцК90 і МБцК50 (бактерицидні концентрації для 90% і 50% тест-штамів відповідно), МБсК90 і МБсК50 (бактеріостатичні концентрації для 90% і 50% тест-штамів), середні геометричні значення. МБцК і МБсК, співвідношення МБцК/ /МБсК. На основі спостережень за динамікою росту періодичних культур стафілококів визначали коефіцієнти відносного пригнічення росту в присутності різних концентрацій препаратів, розраховували значення ІС50 (концентрацій, що викликають пригнічення росту мікробних культур на 50%) в різні терміни експерименту. За допомогою пробіт-аналізу розраховували також значення Ki – концентрації, яка зумовлює двократне збільшення тривалості часу генерації клітин у логарифмічній фазі росту культур (Sompolinsky D. etc., 1973).
Для вияснення впливу особливостей структури синтетичних сполук на їх протимікробну активність використано QSAR (Quantitative structure-activity relationships) підхід (Khan N. etc., 2006, Kuz’min V. E. etc., 2002). Створені QSAR-моделі дозволили здійснити віртуальний дизайн структур з потенційною протимікробною активністю. Окремі теоретично змодельовані структури було синтезовано, і їх активність відносно MRS підтверджено експериментально.
Комп’ютерне моделювання зв’язування похідних тіазолідину з активним центром ферменту біосинтезу пептидоглікану MurB (гнучкий докінг) проведено з допомогою програми Glide (®Maestro, Macromodel, Schrodinger L. L. C), яка оцінює зв’язування ліганду та мішені з допомогою двох різних скорінгових функцій GlideScore (GS) та EnergyModel(EM) (в т. ч. енергії утворення водневих зв’язків, Ван-дер-Ваальсових взаємодій тощо). Альтернативне докінгове дослідження проведено програмою Fred (®Vida2, Omega, Fred, OpenEye Scientific Software). Для докінгових досліджень структури ферменту MurB обрані з Protein Data Bank (PDB, http: // www. rcsb. org/pdb) з кодами: 2MBR – структура виділена з E. coli (Benson T. E. etc., 1997) та 1HSK – структура виділена із S. аureus (Benson T. E. etc., 2001). Пошук моделей з багатьма змінними та відбір дескрипторів проведено за методом часткових найменших квадратів з використанням програм QSAR (®Gaussian03, Gaussian, Inc) та BuildQSAR (De Oliveira D. B., Gaudio A. C., 2000).
Для скринінгової оцінки синергізму дії синтетичних сполук і рослинних екстрактів з антибіотиками відносно стафілококів застосовану оригінальну просту та достатньо чутливу методику (Патент України UA № 27939). В якості тест-штаму використано докладно охарактеризований авторський штам S. aureus "Кунда" (MecA+NorA+MsrA+TetK+). Крім того, мікрометодом серійних розведень в бульйоні визначали ефективні протимікробні концентрації препаратів при їх ізольованому та поєднаному застосуванні. Біоавтографічні дослідження екстрактів виконано за методом A. Nostro і співавт. (2000).
Фармакологічну активність відібраних рослинних екстрактів оцінювали також за їх здатністю пригнічувати адгезію стафілококів до клітин буккального епітелію людини (Ellen R. P. і Gibbons R. J., 1974), гальмувати розвиток проліферативної фази запалення на моделі ватяної гранульоми (D’Arcy P. F. etc., 1960), індукувати продукцію IFN і TNF в культурах клітин in vitro (Ершов Ф.И. і співавт., 1988; Meager A. etc., 1989). В дослідах in vivo на мишах вивчали вплив рослинних екстрактів на інтерфероновий статус організму (рівень сироваткового IFN, здатність спленоцитів в умовах in vitro синтезувати IFN-б у відповідь на введення віруса хвороби Ньюкастл та IFN-г у відповідь на введення ФГА), фагоцитарну активність макрофагів перитонеального ексудату відносно S. aureus 209-Р (Бутенко Г.М. і співавт., 2001) та їх киснево-залежну кіллерну активність в НСТ-тесті (Грачева М.П., 1984).
Токсикологічні дослідження окремих препаратів включали вивчення їх цитотоксичності in vitro в культурі перитонеальних макрофагів мишей (Вильнер Л.М., 1977). Гостру токсичність сполук in vivo оцінювали при різноманітних шляхах введення за значеннями максимально переносимих (МПД) і летальних доз (LD10, LD50 і LD90), встановленими методом пробіт-аналізу (Біленький М.Л., 1963). Також вивчали ефект кумуляції (Гацура В.В., 1974) та подразнюючу дію препаратів (Ієвлєва Е.А., 1974).
Для статистичної обробки результатів мікробіологічних та імунологічних експериментів застосовано методи варіаційної статистики, одно - і двовибірковий F-тест для дисперсії, кореляційний, лінійний регресійний, одно - і двофакторний дисперсійний (ANOVA), багатофакторний об’єднуючий кластерний аналіз, пробіт-аналіз із використанням спеціалізованих комп’ютерних програм WHONET 5.1, UTHSCSA ImageTool 2.0, STATISTICA for Windows 5.0, MSOffice Excel 2003.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
