Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Обсяг і структура дисертації. Матеріал викладено на 167 сторінках друкованого тексту, в тому числі на 29 сторінках цитована література, проілюстровано 23 рисунками, 4 таблицями і 31 мікрофотографією. Дисертаційна робота містить вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення), висновки і бібліографічний список, який включає 295 джерел, в тому числі 236 іншомовних.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на щурах лінії Вістар (самках), віком 3 місяці, вагою 165-215 г, використаних в якості реципієнтів для проведення ауто-, ало- і ксенотрансплантацій. Експерименти на лабораторних тваринах проводились відповідно принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964-2000 р.р.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових товариств, вимогам та нормам 1СН С8Р (2002 р.), типовим положенням з питань етики МОЗ України № 281 від 1 листопада 2000 р., відповідно до положень нормативних документів, введених в дію наказом МОЗ України № 6 від 17 січня 1995 р., а також вимогам “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та наукових цілях” (1986 р. № 123).

Трансплантаційний матеріал, у вигляді комбінованих і монографтів, представлено НФ і органотиповими культурами ендокринних залоз (ЩЗ, НЗ і гіпофізу) статевозрілих щурів і новонароджених поросят (НП). На етапі передобробки трансплантаційного матеріалу проводилось органотипове культивування ендокринних тканин, комбіноване культивування і культивування в присутності модифікаторів гормонопоезу. Для цього в асептичних умовах отримували органні фрагменти із ендокринних залоз щурів і новонароджених поросят розміром 0,5-1 мм³, культивували їх за стандартною методикою (Грищенко В.І. та ін., 2000) протягом 4 діб на живильному середовищі 199/RPMI, збагаченому 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби і йодидом калію (75 мкг/л) з додаванням пеніциліну (100 ОД/мл) і канаміцину/стрептоміцину (100 мкг/мл) при температурі 37 єС в атмосфері 5% СО₂. Для комбінованого культивування 2 видів ендокринних тканин на 3 добу фрагменти ЩЗ і НЗ, а також ЩЗ і експлантати гіпофізу відокремлювали напівпроникливою мембраною і інкубували 24 години, дотримуючись стандартних умов. Для визначення здатності ОКЩЗ відповідати на дію модифікаторів гормонопоезу, на 3 добу культивування в середовище додавали ТТГ (10 мкМО/мл (Sadeh K. et al., 1991)) та інкубували 12 годин при температурі 37єС, тиротропін-рилізинг гормон (ТРГ) в 2 концентраціях (10 нмоль (4,4 нг/мл)) – на 12 годин (Weintraub B.D. et al., 1990) і 200 мкг/мл – на 2 години інкубації (Cheolyoung P. et al., 2005)), дибутирил-циклічного аденозинмонофосфату (дб-цАМФ) (1 ммоль/мл), кортикостерон (в діапазоні концентрацій від 0,25 до 1,0 мкг/мл (Резников А.Г., 1980)). Крім того, ОКЩЗ і ОКНЗ окремо культивували в стандартних умовах протягом 3 діб, а потім інкубували 12 годин, відокремлюючи фрагменти напівпроникливою мембраною в присутності ТТГ і дб-цАМФ у вищезазначених концентраціях. ОКЩЗ і експлантати гіпофіза інкубували з ТРГ (4,4 нг/мл – 12 годин і 200 мкг/мл – 2 години).

Життєздатність культур визначали на останню добу культивування методом суправітального забарвлення трипановим синім клітинної суспензії, отриманої методом ферментативної дезагрегації. Кількість життєздатних клітин (ЖК, %) визначали шляхом підрахунку в гемоцитометрі (Адамс Р., 1983) і знаходили за формулою: ЖК = (∑_{незабарвл}/∑_заг) х 100, де ∑_{незабарвл} – кількість живих (незабарвлених) клітин, ∑_заг – загальна кількість клітин в полі зору.

Післяопераційний гіпотиреоз моделювали за допомогою ретроградної тиреоїдектомії (Легач Е.И., 2005) під комбінованим внутрішньочеревним наркозом (кетамін - 2,5 мг, ксилазин – 0,5 мг/100г маси тіла). З метою запобігання порушення кальцієвого обміну тваринам давали 0,2% розчин кальцію хлориду (Корлэтяну А.Н., 1987; Шкуматов Л.М., и др., 2001).

Трансплантаційний матеріал у дозі 30-35 мг вносили під капсулу нирки. У випадку комбінованої трансплантації з НЗ тваринам здійснювали лівосторонню адреналектомію.

Сакрифікацію тварин проводили на 30 добу після трансплантації під ефірним наркозом. Кров для аналізу брали за допомогою внутрішньосерцевої пункції.

Вміст загального рівня тироксину (Т4) в плазмі крові тварин-реципієнтів і середовищі культивування дослідних зразків ОКЩЗ визначали методом радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів РИА – Т4 – СТ (Білорусь) (Прядко К.А. и др., 2000) и Т4 Immunotech (Чехія) згідно з інструкцією.

Показники концентрації Т4 в середовищі культивування ОКЩЗ нормували на білок, який вимірювали за методом Бредфорда (Bradford, 1976). Рівень ТТГ в плазмі крові щурів-реципієнтів визначали з використанням набору для РІА - ТТГ «Ирма» REF (Угорщина).

Тест толерантності до вуглеводів проводили шляхом внутрішньочеревного введення розчину глюкози (0,1 г глюкози на 100-150 г маси тіла тварини) за 40 хвилин до сакрифікації (Громакова І.А. и др., 2002). Рівень глюкози в крові вимірювали фотоколориметричним методом в модифікації Н.В. Клімкіної (Пушкина Н.Н., 1963) та експрес-методом за допомогою глюкометру “Глюкофот” та індикаторних пластин “Гемоглан” (Україна).

Рівень альбуміну в плазмі крові визначали фотоколориметричним методом за реакцією з бромкрезоловим зеленим стандартним тест-набором Альбумин “Филисит Диагностика” (Україна), рівень холестерину - набором Chol 150 “Lachema” (Чехія) згідно з інструкціями. Фотоколориметричні визначення проводили з використанням ФЕК (КФК-2-УХЛ42).

Підготовку матеріалу до гістологічних досліджень проводили в стандартних умовах. Нирку з трансплантатом або фрагменти культури фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, зневоджували етанолом і заливали у парафінові блоки. Зрізи товщиною 5-7 мкм виготовляли так, щоб гістологічна поверхня включала трансплантат і оточуючі тканини – паренхіму і капсулу нирки. Зразки забарвлювали гематоксиліном та еозином. Препарати досліджували під світлооптичним мікроскопом при збільшеннях об’єктиву х20, х40 і х60. Мікрофотографії отримували за допомогою мікроскопу Olimpus з цифровою камерою і пакетом прикладних програм для обробки зображення.

Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента і однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) - для непараметричних даних.

Результати досліджень та їх обговорення

Морфофункціональні властивості органотипових культур щитоподібних залоз в умовах специфічної і неспецифічної стимуляції та комбінованого культивування. Одним із якісних параметрів оцінки функціонального стану культури є її здатність відповідати на стимуляцію змінами гормональної активності. Функціональним параметром життєздатної культури прийнято вважати її здатність виключати із клітин суправітальні барвники (розчин трипанового синього тощо). Дані, представлені в табл. 1 свідчать, що показник життєздатності клітин ОКЩЗ НП після комбінованого культивування з ОКНЗ був на 19,53% вищий за такий клітин монокультур ОКЩЗ НП.

Таблиця 1

Вплив комбінованого культивування двох видів ендокринних тканин на життєздатність клітин ОКЩЗ щурів і новонароджених поросят (М±m, n=7)

Примітка.¹ за 100%-в прийнято кількість життєздатних клітин інтактних ЩЗ.

Аналогічна тенденція зберігалась і в комбінованих з НЗ ОКЩЗ щурів. Зафіксовано відносне збільшення життєздатних клітин в ОКЩЗ після комбінованого культивування з експлантатами гіпофізу (табл.1).

Вивчення гормональної активності ОКЩЗ щурів після культивування в присутності специфічних і неспецифічних стимуляторів гормонопоезу показало, що на 4 добу інкубації рівень базальної секреції Т4 ОКЩЗ в середовище культивування складав 50,59±0,6 нмоль/г білка (n=8, р<0,05). Це значення було прийнято за контрольне по відношенню до всіх експериментальних зразків, отриманих із ЩЗ щурів.

Із представлених на рис. 1 (А) даних видно, що сумісна інкубація ОКЩЗ з експлантатами гіпофізу супроводжувалась вірогідним збільшенням рівня секреції тироксину в середовище інкубації.

Активація Т4-гормонопоезу спостерігалась і у випадку застосування дб-цАМФ. Крім того, виявлено, що біологічно активні речовини НЗ стимулювали секрецію Т4 при комбінованому культивуванні ОКЩЗ із ОКНЗ. Рівень тироксину в середовищі за таких умов культивування складав 124,02±12,4 нмоль/г білка (n=6, р<0,05) в порівнянні з контрольним значенням - 50,59±0,6 нмоль/г білка (n=8, р<0,05). Однак, при інкубації тканин ЩЗ і НЗ в присутності дб-цАМФ отримано ефект відміни дії стимулятора (рис.1 (А)).

При спробі відокремити дію глюкокортикоїдів від загального впливу ОКНЗ встановлено, що залежність концентрації тироксину в середовищі культивування від концентрації кортикостерону мала лінійний характер (рис. 1 (Б)). Додавання 0,25 мкг/мл кортикостерону стимулюючим ефектом не супроводжувалось, а при збільшенні його концентрації до 0,5-1,0 мкг/мл зростав і рівень Т4. Слід зазначити, що концентрація кортикостерону в плазмі периферійної крові щурів значно нижча, ніж в плазмі венозної надниркової крові (Резников А.Г., 1980), тому, для більш коректної інтерпретації даного ефекту, за фізіологічне значення слід приймати концентрацію 0,5 мкг/мл.

Отримані дані свідчать про здатність ОКЩЗ щурів реагувати на дію стимуляторів шляхом ТТГ-рецепторної і неспецифічної внутрішньоклітинної відповіді. Процеси, що відбуваються в ОКЩЗ на клітинному рівні під дією дб-цАМФ полягають у здатності цАМФ і його аналогів запускати аденілатциклазний каскад і, тим самим, індукувати синтез і секрецію тиреоїдних гормонів (Steinfelder H.J. et al., 1991; Steinfelder H.J. et al., 1992; Weintraub B.D. et al., 1989). Оскільки кортикостерон також стимулював секрецію Т4 (в залежності від концентрації), припустимо, що з усього спектру біологічно активних речовин НЗ саме глюкокортикоїди стимулювали секрецію тироксину ОКЩЗ щурів в умовах сумісного культивування з ОКНЗ.

При культивуванні ОКЩЗ новонароджених поросят виявлено, що на 4 добу інкубації базальний рівень секреції Т4 в середовище культивування складав 36,29±1,79 нмоль/г білка (n=8, р<0,05) (рис. 2), дане значення було прийняте за контрольне по відношенню до зразків, отриманих із ендокринних залоз новонароджених поросят.

Представлена концентрація Т4 у середовищі культивування після інкубації ОКЩЗ НП в присутності модифікаторів гормонопоезу, звідки бачимо, що 2-годинна інкубація з концентрацією ТРГ 200 мкг/мл не супроводжувалась істотним збільшенням рівня Т4 в середовищі культивування в порівнянні з 12-годинною інкубацією в присутності 4,4 нг/мл ТРГ. Рівень тироксину в останньому випадку вірогідно зростав більш ніж в два рази порівняно з контрольними параметрами і складав 104,55± 4,67 нмоль/г білка (n=7, р<0,05). Інкубація ОКЩЗ НП протягом 2 годин в присутності ТРГ (200 мкг/мл) і експлантатів гіпофізу також не стимулювала секрецію тироксину, а 12-годинна інкубація зазначених тканин з 4,4 нг/мл ТРГ сприяла деякому зниженню рівня Т4 в середовищі культивування в порівнянні з його базальними значеннями, що може бути пов’язано з впливом ТРГ на гіперпродукцію ТТГ і супресію секреції Т4. 24-годинна інкубація ОКЩЗ НП з експлантатами гіпофізу супроводжувалась вірогідним збільшенням рівня Т4 в середовищі культивування. Дані ефекти підтверджують припущення щодо підтримання сигнальних регуляторних взаємовідносин в системі гіпоталамус-гіпофіз-ЩЗ, змодельованій in vitro.

Комбіноване культивування ОКЩЗ НП з ОКНЗ НП вірогідно збільшувало рівень Т4 в середовищі культивування (рис. 2 (А)). Додавання в інкубаційне середовище дб-цАМФ також стимулювало Т4-гормонопоез, але при дії дб-цАМФ на комбіновані культури (ОКЩЗ НП із ОКНЗ НП) рівень секреції Т4 був нижчий в порівнянні з окремою дією стимулятора та вищий за контрольне значення. При інкубації ОКЩЗ НП із ОКНЗ НП і ТТГ (10 мкМО/мл) зафіксовано аналогічний ефект відміни стимулюючої дії модифікатора (рівень Т4 в середовищі інкубації не відрізнявся від контрольних значень).

Отримані результати дозволяють стверджувати, що комбіноване культивування в присутності стимуляторів не приводить до вірогідного збільшення рівня тироксину в середовищі культивування на відміну від вираженого стимулюючого впливу кожного модифікатора окремо.

Як видно з даних, представлених на рис. 2 (Б), кортикостерон вірогідно збільшував рівень секреції тироксину в середовище культивування ОКЩЗ НП по відношенню до контролю. При цьому фізіологічні концентрації зумовлювали максимальний стимуляторний ефект. Так, внесення 0,5 мкг/мл кортикостерону (фізіологічна норма плазми венозної надниркової крові щурів) сприяло вірогідному підвищенню рівня тироксину в середовищі культивування ОКЩЗ як щурів (рис. 1 (Б)), так і новонароджених поросят (рис. 2 (Б)), тоді як додавання в інкубаційне середовище 0,25 мкг/мл кортикостерону стимулювало секрецію Т4 тільки культурами ЩЗ новонароджених поросят.

Корекція експериментального гіпотиреозу і супутніх порушень метаболізму шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур щитоподібних і надниркових залоз. Комбінована трансплантація двох видів ендокринних тканин/клітин може бути як одним із способів імунопротекції основного графту (De Fazio S.R. et al., 1994), покращення його трофіки (Agrawal A.K. et al., 2004; Emerich D.F. et al., 2003), так і способом локального впливу на регуляторно-трофічні процеси в самому трансплантаті (Kukreja S.C. et al., 1979).

З метою оцінки ефекту комбінованої трансплантації тканин ЩЗ і НЗ на вміст тироксину і тиротропіну в плазмі крові гіпотироїдних щурів, а також на деякі показники метаболічних процесів і ступінь їх компенсації проводилась трансплантація монографтів і комбінованих ауто-, ало- и ксенографтів НФ і органотипових культур ЩЗ та культур ЩЗ і НЗ з попереднім сумісним культивуванням щурам з післяопераційним гіпотиреозом. Отримані показники порівнювали з відповідними в групах тиреоїдектомованих та інтактних тварин. На 30 добу після трансплантацій в плазмі крові експериментальних тварин вимірювали вміст Т4, ТТГ і деяких біохімічних показників – альбуміну, глюкози з вуглеводним навантаженням і холестерину та проводили гістологічні дослідження екстирпованих трансплантатів.

Вміст тироксину в плазмі крові контрольних тварин дорівнював 61,71±1,1 нмоль/л (n=7, р<0,05), у тиреоїдектомованих – 18,26±0,8 нмоль/л (n=7, р<0,05) (рис. 3), що свідчить про адекватність моделі післяопераційного гіпотиреозу.

Трансплантати НФ ЩЗ алогенного походження виявились більш ефективними в корекції гіпотиреоїдного стану (рис. 3 (А)), що зумовлювалось менш вираженими процесами відторгнення трансплантату завдяки видовій специфічності тканин донора і реципієнта.

Характеристики

Список файлов реферата