Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 6)

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК.

Комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой специально синтезированнные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 - 30 оснований, называемые праймерами.

Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает между ними. Процесс амплификации заключается в повторениии циклов, состоящих из денатурации ДНК, отжига праймеров и синтеза фрагмента ДНК, проходящих при различной температуре, и проводится на приборе с программным контролем температурного режима - термоциклере. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n - число циклов амплификации. После 30 - 35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагмента - ампликонов, что делает возможным определение и визуализацию их электрофоретической подвижности в агарозном или акриламидном геле. Праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды микроорганизмов.

Показания к применению метода

Показания к применению нового метода начинаются там, где возникают противопоказания к применению классических методов. Идентификация патогена путем микробиологического культивирования из образцов спинномозговой жидкости или крови больного, оставаясь "золотым стандартом" диагностики, имеет серьезные ограничения, обусловленные применением антибиотиков на догоспитальном этапе. Согласно Приказу № 375 МЗ РФ "…на дому следует ввести разовую дозу пенициллина, а при тяжелой менингококцемии предпочтительнее введение левомицетина-сукцината". Подобная практика улучшает прогноз заболевания, но резко снижает число образцов СМЖ, пригодных для микробиологического и последующего эпидемиологического анализа.

В последние годы около половины больных ГБМ, поступавших в инфекционную клиническую больницу получали антибиотики на догоспитальном этапе; при этом в группе больных, получавших антибиотики на дому, летальность была менее 5%, а культуру бактерий из СМЖ (или крови) удавалось получить лишь в 30% случаев; напротив, в группе больных, не получивших антибиотики, летальность была выше 10%, а культуру бактерий получали как минимум в 60% случаев. Кроме того, бактериологическая диагностика занимает не менее суток. Таким образом, ситуация требует разработки и применения "некультуральных" методов идентификации возбудителей ГБМ.

Известным "некультуральным" методом выявления антигенов возбудителей ГБМ является метод латекс-агглютинации (ЛА) с применением соответствующих коммерческих тест-систем. Латексные частицы, покрытые специфическими антителами к антигенам Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae или Haemophilus influenzae, агглютинируют в присутствии бактериальных антигенов, содержащихся в СМЖ; результат агглютинации оценивается визуально. Постановка всей реакции занимает около 10 мин, реакция не требует наличия живых бактерий в СМЖ. Однако чувствительность метода ЛА сравнительно невысока, порядка 70%, что не удивительно, поскольку минимально определяемая концентрация бактерий в СМЖ методом ЛА составляет от 10⁵ до 5*10⁶ бактерий/мл или от 1 до 50 нг антигена/мл. При этом стоимость тест-систем в пересчете на одну диагностическую реакцию не менее $8.

Основные достоинства ПЦР:

• возможность выявления даже нескольких копий генома бактерий в образце и, как следствие; максимальная диагностическая мощность;

• чувствительность и специфичность, достигающие 100%, высокая воспроизводимость;

• сжатые (в течение нескольких часов) сроки исследования;

• умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость (от 100 рублей на одну

• реакцию).

Показаниями к генодиагностике ГБМ являются:

• отрицательные результаты диагностики иными методами;

• использование для диагностики образцов СМЖ, взятых после антибиотикотерапии или на поздних стадиях болезни;

• необходимость срочного диагностического результата;

• замещение дорогостоящих иммунологических методов.

Прямых противопоказаний к применению генодиагностики ГБМ не существует. Однако, с одной стороны, ПЦР способна выявить малейшее бактериальное загрязнение тестируемого образца и рабочих растворов; с другой стороны, в ряде биологических жидкостей, в том числе, СМЖ возможно присутствие ингибиторов ПЦР. Поэтому только использование при постановке реакции положительных и отрицательных контролей, высокое и периодически проверяемое качество всех используемых реагентов, аккуратность выполнения исследования позволяют избежать как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.

Выделение ДНК

Основное необходимое оборудование и расходные материалы:

1) настольный бокс с бактерицидной лампой ("Циклотемп", СП "РТС");

2) термостат для пробирок типа “эппендорф” на 25-1000С ("Биоком");

3) микроцентрифуга до 12-16 тыс. g. ("Elmi", "Hettish");

4) центрифуга /вортекс (“"Биоком");

5) набор автоматических пипеток переменного объема («Биоком»);

6) одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для пипеток переменного объема, одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки на 1,5 мл («Биоком», «Хеликон»);

7) отдельный халат и одноразовые перчатки. Аналогичное оборудование и материалы общелабораторного назначения понадобится и на следующих этапах.

ДНК из бактериальной суспензии выделяется стандартными методами лизиса/сорбции/отмывания (например, с использованием наборов “ДНК-сорб”, ЦНИИ эпидемиологии) или фенол-хлороформной экстракции. Концентрации ДНК в пробе при необходимости можно определить спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Число микроорганизмов, эквивалентных данной концентрации ДНК, рассчитывается исходя из приблизительного соотношения: 1 бактериальная клетка содержит 4 фемтограмма ДНК.

Образцы СМЖ можно использовать в реакции амплификации непосредственно; перед исследованием проба (100 мкл СМЖ, покрытые сверху 100 мкл минерального масла) инкубируется в термостате для микропробирок 20 минут при 99⁰С для разрушения бактерий, после чего центрифугируется при 10000 g в течение 1 минуты при комнатной температуре и супернатант отбирается для постановки ПЦР. Концентрацию и чистоту ДНК в подобной пробе можно повысить, добавив этап выделения путем сорбции. При этом, чтобы убедиться, что в каждом образце СМЖ выделение ДНК прошло успешно, в образец СМЖ пред выделением ДНК добавляется внутренний контроль - препарат ДНК, например, вируса гепатита В (HBV), а также приготовляется дополнительная пробирка без СМЖ, но с HBV, которая представляет собой отрицательный контроль выделения. В дальнейшем для каждого образца СМЖ ставится реакция на выявление ДНК HBV, которая должна дать положительные результаты.

Анализ и учет результатов

Продукты амплификации выявляются и дифференцируются методом электрофореза в 1.8% агарозном геле, содержащим бромистый этидий, с дальнейшей визуализацией геля при подсвечивании ультрафиолетовым излучением. Длина амплифицированного фрагмента гена 16S РНК Neisseria – 341 пар нуклеотидов, Haemophilus - 516 п.н., Streptococcus– 792 п.н., длина специфических ампликонов N. meningitidis серогруппы А – 349 п.н., группы В – 539 п.н., С- 209 п.н.. Фиксацию, хранение и анализ полученных изображений гелей удобно проводить с помощью специализированных систем обработки изображения (Gel-Doc, БиоРад; BioTest, ЦНИИ эпидемиологии); однако при небольшом объеме исследований возможна и непосредственная визуальная оценка и/или фотографирование результатов.

Ожидаемый эффект от внедрения метода

Эффективность использования метода складывается из нескольких компонентов:

Во-первых, ПЦР позволяет диагностировать в два с половиной раза больше случаев менингококкового менингита и в два раза больше случаев пневмококкового менингита по сравнению с культивированием.

По сравнению с методом ЛА, ПЦР можно выявить в два раза больше случаев менингококкового менингита и в 1.4 раза больше случаев пневмококкового менингита. В случае менингита, вызываемого гемофильной палочкой типа b, эффективность ПЦР и ЛА приблизительно одинаковы, что вероятно объясняется большим накоплением бактериального антигена в СМЖ при данной патологии. Во-вторых, сроки ПЦР-диагностики составляют 3-4 часа, а микробиологической диагностики – более суток.

В-третьих, себестоимость микробиологической диагностики, дополненной методом ЛА, - не менее 500 руб. на одного пациента, а себестоимость ПЦР-диагностики бактериальных инфекций в условиях ЦННИ эпидемиологии - менее 50 руб.

Клинические подходы к терапии менингитов различной этиологии не совпадают, поэтому своевременная дифференциальная диагностика является важным элементом эффективного лечения. Кроме того, расширенное серогруппирование менингококков позволяет при определенной ситуации принять решение о выборочной или массовой вакцинации населения.

Задачи

Идентификация и классификация бактерий, вызывающих инфекционные заболевания, относятся к числу ключевых задач как прикладной, так и фундаментальной микробиологии и эпидемиологии.

Эпидемиолог должен быть готов ответить на два достаточно различных типа вопросов:

1) Являются ли штаммы изолированные в конкретном очаге заболевания идентичными, генетически родственными или не взаимосвязанными? Это задача краткосрочного и локального эпидемиологического расследования. Результатом такого расследования должно стать устранение возбудителя инфекции из окружающей среды, определенных продуктов и других источников инфекции, включая людей.

2) Как связаны штаммы, циркулирующие на данной территории, со штаммами, распространенными на других территориях или в другие годы? Это задача долгосрочного и глобального эпидемиологического анализа. Итогом анализа должно стать выяснение закономерностей распространения, циркуляции и эволюции патогенных штаммов и клонов и создание методов эпидемиологического надзора и прогноза, учитывающих эти закономерности.

Сроки выдачи ответов и их формулировка

При бактериологическом обследовании ликвора и крови сроки выдачи и формулировка ответов таковы:

На 1-й день на основании прямой бактериоскопии ликвора и толстой капли крови дают предварительный ответ, в зависимости от результата формируется в трех вариантах:

а) при наличии в мазках большого числа морфологически типичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены грамотрицательные кокки (или грамположительные палочки), сходные по морфологии с менингококками, или пневмококками, или H.influenzae. Исследование продолжается";

б) при наличии в мазках единичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены единичные (или парные) клетки кокков (или палочек и т.д.). Исследование продолжается";

в) при отсутствии каких-либо бактериальных клеток пишут: "В спинномозговой жидкости (крои) при прямой бактериоскопии бактерий не обнаружено".

На основании результатов серологических реакций (ВИЭФ, ЛА и др.) ликвора дают ответ, который в зависимости от результатов формулируют следующим образом:

а) при выявлении специфического антигена пишут: "В спинномозговой жидкости выявлен специфический антиген (менингококквый, пневмококковый и H.influenzae тип "В" и др.)\";

б) при отрицательном результате пишут: "В спинномозговой жидкости специфические антигены не выявлены".

На 2-й день выдают ответ также предварительного характера, который в зависимости от результатов бактериологического исследования формулируют следующим образом:

а) при росте бактерий, типичных по морфологическим и культуральным свойствам для нейссерий и других родов, пишут: "При прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) получен рост нейссерий (или стафилококков, стрептококков, грамотрицательных палочек и др.). Изучение культуры продолжается";

б) при наличии четко выраженной реакции агглютинации выросшей культуры с одной из специфических сывороток и положительной бактериоскопии мазка может быть дан окончательный положительный ответ: "При исследовании спинномозговой жидкости (крови) получен рост: H.influenzae, N.meningitidis, Str.pneumoniae и др.)";

в) при отсутствии роста пишут: "При прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) роста бактерий не обнаружено. Исследование продолжается."

На 3-й день на основании культурально-биохимический свойств бактерий, отсеянных с чашки на 2-й день, выдают окончательный ответ: "Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура менингококков серогруппы А, В и т.п. (или негруппируемая)". В редчайших случаях "M.catarrhalis или непатогенные нейссерии".

В этот же день может быть дан предварительный ответ о росте (или его отсутствии) бактерий в результате высева из среды обогащения. Формулировка та же, что и при оценке результатов прямого посева с чашки. В этот же день выдают окончательный положительный ответ на пневмококки, который формулируют: "Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура Str.pneumoniae".

На 4-й день может быть выдан окончательный положительный ответ о видовой принадлежности нейссерий, выросших при прямом посеве, а также других бактерий.

На этом же этапе, как и в следующие дни (вплоть до 5-го дня), может быть выдан окончательный положительный ответ, полученный в результате высева из Среды обогащения. Формулировка та же.

Окончательный отрицательный ответ выдают не ранее 5-го дня, когда при последнем высеве из среды обогащения (на 5-й день ее инкубации) не обнаруживают роста бактерий. Его формулировка: "При инкубации спинномозговой жидкости (крови) на среде обогащения в течение 5 дней бактерий выделить не удалось".

При бактериологическом исследовании отпечатков-мазков из петехий больного или кусочков трупного материала дают предварительный ответ, который в зависимости от результатов формулируется в трех вариантах.

Окончательный отрицательный ответ выдается не ранее 5-го дня с момента посева исследуемого материала.

При бактериологическом исследовании слизи из носоглотки выдают только окончательные ответы. Сроки выдачи и формулировки следующие: на 4-й день при выделении культуры менингококка выдают положительный ответ: "В носоглоточной слизи обнаружены менингококки определенной серогруппы или негруппируемые".

В случаях добавочного отсева колоний с чашек, а также при использовании полужидкой среды обогащения сроки выдачи ответа соответственно отодвигаются на сутки. При отсутствии роста менингококков в посевах выдают отрицательный ответ: "В носоглоточной слизи менингококк не обнаружен".

Заключение

Из-за полиэтиологичности возбудителей вопросы эпидемиологии и профилактики бактериальных менингитов неоднозначны и зависят от вида возбудителя, вызвавшего менингит. В этой связи основополагающей составляющей в надзоре за бактериальными менингитами является микробиологический мониторинг, позволяющий определять их этиологическую структуру на каждой конкретной территории за определенный временной период. Этиологическую расшифровку следует рассматривать как важное противоэпидемическое мероприятие, которое обеспечивает:

• правильное и своевременное проведение этиотропной терапии, а, следовательно, снижение инвалидизации и летальности;

• адекватное использование вакцинных препаратов в соответствии с антигенными особенностями возбудителя;

• оценку значимости той или иной бактериальной флоры в этиологии бактериальных менингитов за конкретный период времени и решение вопроса поиска путей и перспектив борьбы с определенной формой менингита.

В этой связи является очевидным, что только рационально организованная, комплексная, современная лабораторная диагностика бактериальных менингитов любой этиологии позволит достоверно контролировать состояние этой инфекционной патологии и значительным образом снижать трагическое влияние бактериальных менингитов на популяцию людей.

Список использованных источников

1. Практическое руководство по антимикробной химиотерапии./ Под ред. Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. - М., Изд-во "Боргес". - 2002. - 384с.

2. Яковлев С.В. Бактериальные менингиты в отделении интенсивной терапии. - 2001. - Т. 3.,- №11.

3. Королева И.С. Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты. МИА – Москва, 2007. Стр: 112.

4. Покровский В.И. Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей. 2001г.

5. Методические указания МУК 4.2.1887-04 "Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов";

6. Приказ № 375 О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов от 23 декабря 1998 г.

Характеристики

Список файлов реферата