90942 (679581), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Позже было установлено, что длина молекулы кратна не 4, а 4,4D (D – длина периода 64 нм). Молекулы, упакованные в фибриллу, в линейной проекции разделены промежутком 0,6 D (зона «пустоты»), а соседние параллельные ряды молекул сдвинуты относительно друг друга на величину периода D, причем они перекрывают концы параллельных им молекул на 0,4 D (зона «перекрытий»).

Таким образом, вдоль фибриллы чередуются зоны «пустот» и «перекрытий», которые на негативно окрашенных электронограммах отражаются соответственно в темных и светлых полосах периода [Ktihn К., 1969; BrunsR. R., Gross J., 1974; Miller A., 1976]. Вся структура стабилизована за счет поперечных связей между молекулами.

Описанная картина укладывается в двухмерную модель упаковки молекул коллагена, изучение же трехмерной структуры сопряжено со значительными трудностями. Одной из наиболее признанных является модель J.W. Smith (1968), по которой пять молекул, сдвинутых между собой на ID, соприкасаясь боковыми поверхностями, уложены в цилиндрический филамент, причем пятая молекула сдвинута по отношению к первой на 4D. Такой филамент растет в длину за счет присоединения новых молекул, а в ширину фибрилла растет только путем соединения филаментов между собой. Внутри филамента молекулы свернуты в спираль [Piez К.А., 1975]. Близка к этому и модель A. Veis н соавт. (1967), в которой предусматривается, что филаменты состоят из четырех молекул коллагена. Следует отметить, что диаметр филаментов по этим моделям (3,5 нм в сухом и 5 нм во влажном состоянии) совпадает с размерами минимальных филаментов (прото- или микрофибрилл), обнаруженных внутри тканевых коллагеновых фибрилл [Olsen В. R., 1963; Doyle В.В. et al., 1974; Brims R.R., 1976], а также в поперечно исчерченных филдментарных агрегатах (см. раздел 2.2.6).

По данным М. Bouteille, D. С. Pease (1971), J.H. Lillie и соавт. (1977), при «инертной» дегидратации, воздействии мочевины или гуанидинхлорида происходит диссоциация фибрилл на филаменты толщиной 3,5–4 нм, причем выявляется спиралевидное скручивание этих филаментов. Спиральная структура коллагеновых фибрилл обнаруживается также при применении метода замораживания – раскалывания [Rayns R. et al., 1974; Belton J. С. et al., 1975], вероятно, в результате использования агентов, разрушающих водородные связи. В некоторых случаях спиралевидная структура фибрилл отмечается и при обычной заливке, например в опухолях [Manabe Т., Kajikkawa V., 1976]. Подобные изменения были обнаружены в склере при резко выраженной близорукости.

В заключение следует отметить, что пока не существует общепризнанной модели трехмерной структуры фибриллы, которая полностью отвечала бы рентгеноструктурным и электронно-микроскопическим данным. Обсуждаются возможности тетрагональной и гексогональной решетки, цилиндрической (в форме вставленных друг в друга цилиндров из слоев молекул) и спиральной (закрученной в рулон) упаковки молекул в фибриллу [Miller A., 1976].

1.3 Данные ЯМР о структуре связанной воды в коллагене с помощью сканирующей калориметрии

В состав нативного (неповрежденного) коллагена входит связанная вода, составляющая около 2/3 (или ∼66%) от полной массы сухожилия. Установлено, что вода играет существенную роль в механизме самосборки молекул коллагена и образования фибрилл в цитоплазме коллагеноцитов, а также в механизмах биохимической активности и функционировании коллагена во внеклеточном пространстве живого организма [1]. Однако до настоящего времени принципиальный характер гидратной структуры коллагена остается невыясненным. По данным ²Н ЯМР спектроскопии сухожилий хвоста крысы, обогащенной тяжеловодородной водой ²H₂O, было установлено, что в ″плотных″ участках структуры коллагена молекулы связанной воды (²Н₂О) характеризуются константами квадрупольного взаимодействия (ККВ) ядер ²Н ~3 кГц (в интервале от +20° до ∼+5 °C).

При отрицательных температурах ККВ возрастают, достигая значений ~8 кГц при –10 °C, и тенденция к увеличению ККВ сохраняется при дальнейшем понижении температуры. Относительно малая величина ККВ и ее плавные изменения типичны для процессов диффузионной подвижности молекул воды в нанопористых системах цеолитового типа. Фазовые переходы в подобных системах, как правило, являются переходами типа порядок–беспорядок (близкими к фазовым переходам второго рода) и не сопровождаются резкими тепловыми эффектами.

В то же время по данным ²Н ЯМР водная подсистема коллагена в областях ″щелей″ характеризуется очень малыми значениями ККВ (близкими к нулевым), что указывает на сильную раз-упорядоченность подсистемы связанной воды в ″рыхлых″ участках структуры коллагена. Обнаружено также, что в окрестности температуры замерзания воды (∼273 K) скачкообразным образом изменяется спектр ²Н ЯМР сухожилия. Интенсивная центральная линия, относимая нами к рыхлым участкам структуры коллагена, становится ненаблюдаемой, что может указывать на фазовый переход первого рода. Данный факт косвенно свидетельствует в пользу модели, в соответствии с которой ″рыхлые″ участки структуры коллагена представляют собой тектогидрат, или структуру, включающую непрерывный трехмерный каркас из молекул воды с тетраэдрической координацией, характерной для льда и клатратных гидратов. В этом случае значение ККВ и ширина спектра ²Н ЯМР должны возрастать на два порядка по сравнению с комнатной температурой, соответственно амплитуда сигнала должна упасть на два порядка, что согласуется с экспериментом. Однако для прямого подтверждения подобной модели расположения молекул воды необходимо получить термодинамические характеристики данного фазового перехода.

В данной работе был проведен анализ величины скрытой теплоты фазового перехода в сухожилиях хвоста крысы с использованием метода сканирующей калориметрии. Для исследований были взяты образцы сухожилия RTT экспериментальных животных линии ″Вистар″, содержавшихся на стандартном питании. Возраст крыс составлял 6 месяцев, численность в группе – 3 животных. Образцы волокон сухожилий весом 100–150 мг изымали непосредственно перед исследованием. Измерения проводили в интервале от комнатной температуры (+20 °С) до –30 °С, скорость изменения температуры 3 град./мин. при использовании автоматического калориметра ДСК‑204 фирмы Netzsch (Германия). Результаты измерений представлены в таблице.

Полученные данные можно сравнить со справочными параметрами для скрытой теплоты плавления чистого льда: Q_пл(лед) = 333,5 Дж/г [6]. При сравнении следует учитывать, что в сухожилиях содержание коллагена достигает 94%, а содержание воды в нативном коллагене составляет ∼66%. Распределение связанной воды между плотными и рыхлыми участками достоверно не установлено, но по данным ЯМР ²Н [5] в ″рыхлых″ участках коллагена содержится примерно половина общего содержания воды в сухожилии. Таким образом, если структура подсистемы молекул воды в вакансионных участках нативного коллагена при отрицательных температурах соответствует структуре тектогидрата (клатратоподобного или льдоподобного типа), то ожидаемая скрытая теплота фазового перехода в данной подсистеме должна составить

Q_пер = ~(0,66⋅0,5⋅0,94)⋅Q_пл(лед) = ∼94 Дж/г,

что находится в хорошем согласии с измеренными значениями для трех образцов.

На кривых охлаждения наблюдаются пониженные значения Q_пер, что является следствием значительного переохлаждения образцов при понижении температуры. Данный эффект позволяет получить оценочное значение теплоемкости c_p высокотемпературной фазы подсистемы молекул воды, испытывающей фазовый переход. В рамках обсуждаемой модели среднее значение величины изменения теплоты фазового перехода ΔQ_пep = 16,55 ± 3,9 Дж/г должно быть связано со средней величиной температуры переохлаждения ΔТ = (11,5 ± 0,7)° соотношением

ΔQ_пep = ~(0,6⋅0,5⋅0,94)⋅Δс_рΔT,

где Δс_р – разность между теплоемкостью воды и льда. Если свойства водной подсистемы, испытывающей фазовый переход в коллагене, соответствуют свойствам свободной воды и льда, то Δс_р = 2,062 Дж/г (вблизи 0 °С [6]). Отсюда рассчитанная величина ΔQ_пер = ∼6,69 Дж/моль; пониженное по сравнению с экспериментом значение расчетной величины ΔQ_пер может указывать на существование вклада в Δс_р, связанного с взаимодействием молекул воды и функциональных группировок в белковой структуре. Таким образом, на качественном уровне величина скрытой теплоты фазового перехода находится в согласии с моделью, согласно которой свойства примерно половины связанной воды в структуре коллагена близки к свойствам свободной (или объемной) воды. Повышенные температура плавления льда связанной воды в коллагене и разница значений теплоемкости Δс_р могут указывать на некоторую взаимосогласованность структур воды и фибриллярного белка, возможно, клатратного типа.

2. Способы иммобилизации коллагена из различных органов и тканей. Возможность применения в иммобилизации коллагенов сухожилий

Для растворения коллагена используются различные методики, но большинство из них основано на растворении в уксусной кислоте.

Энуклеированные замороженные глазные яблоки свиньи (–20°) размораживают при комнатной температуре, склера отделяется от остатков мышц, связок и пигмента и промыта холодной водой. Полученная ткань может храниться в замороженном виде в течение 3–4 недель. Выделение коллагена. 100 г. очищенной склеры заливается 5 л щелочного раствора (66 г. NaOH + 100 г. Na₂SO₄ на 1 л раствора) и при периодическом перемешивании выдерживается при 20° в течение 36 ч. При этом полисахариды и протеогликаны, составляющие значительную часть склеры, переходят в раствор. Затем склеру отделяют от раствора на воронке Бюхнера и промывали 10 л дистиллированной воды. Для нейтрализации щелочи ткань обрабатывают 2%-м H₃BO₃ в течение 40 мин при перемешивании на магнитной мешалке. Обработку склеры раствором борной кислоты повторяют 4 раза до установления pH раствора 6.0. После нейтрализации щелочи склеру 4 раза отмывают от H₃BO₃ и Na₂SO₄ дистиллированной водой (5 л), каждый раз в течение 40 мин при 20° при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Степень отмывки определяют по полному удалению (SO₄) – (реакция с BaCl₂). Получение раствора коллагена. К отмытой склере добавляют равное по объему количество 0.3 M CH₃COOH и выдерживают полученную гелеобразную полупрозрачную массу в течение 7–8 сут при 4° и слабом перемешивании. В этих условиях коллаген переходит в раствор, и склера растворяется практически без остатка. Полученный раствор гомогенизируют и фильтруют через стеклянный фильтр с размером пор 160 мкм, используя водоструйный насос. Концентрация коллагена в полученном растворе (по сухому остатку) составляет 2% по массе. Часть полученного раствора разбавляли 0.2 М Na‑ацетатным буфером с pH 3.44 до концентрации 8.6⋅10–6 и 8.6⋅10–7 М.

Определение концентрации. Содержание коллагена в пробах определяют модифицированным методом Лоури [18] при помощи реактива Фолина–Чиокалто. В качестве стандарта используют раствор желатины известной концентрации. Регистрацию проводят спектрофотометрически при λ = 750 нм. Реакционная смесь состоит из 0.04 М CuSO₄, 0.11 М Na₂C₄H₄O₆, 0.05М Na₂CO₃, 0.4 М NaOH, реактива Фолина–Чиокалто и коллагенового раствора. Метод основан на регистрации окрашенного соединения, образующегося при взаимодействии белка с реактивом Фолина [19].

Известен способ получения коллагена по патенту США 5106949, МПК A 61 K 35/32, опубл. 21.04.1992 г. Согласно патенту коллаген получают из сухожилий (предпочтительно сухожилий сгибателя копыта телят). Далее производят следующие операции:

– удаляют оболочки сухожилий;

– измельчают материал;

– промывают измельченный материал физиологическим фосфатным буфером (PBS) (2 г хлористого калия КС1, 2 г однозамещенного фосфорнокислого калия KH₂РО₄, 80 г. хлористого натрия и 79,3 г двузамещенного фосфата натрия на 1 л раствора), рН 6,5–8,5, разбавленным 1:3–1:1; наиболее эффективен разбавленный 1: 3 PBS с ионной силой 0,05 М (0,05 молярного) NaCl и 0,0022 М Na₂HPO₄ (6‑кратная промывка по 2 ч);

– экстрагируют коллаген слабой кислотой (0,5–2 М уксусная кислота); предпочтительно 0,5 М уксусная кислота с добавкой 4 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА);

– осаждают коллаген с помощью NaCl (0,6–1,8 М);

– выделяют осадок и растворяют его в уксусной кислоте;

– переводят раствор диализом в 0,01 М уксусную кислоту.

Данные методики не противоречат целям исследования ввиду того, что и склера и сухожилия построения одним и тем же типом коллагена, т.е. все указанные типы взаимодействия белка с реактивами применимы в обоих случаях иммобилизации.

Заключение

Важной особенностью коллагена и других биологических полимеров является их способность образовывать комплексы с различными лекарственными веществами для направленного действия: усиливающих свертывание крови, стимулирующих восстановление соединительной ткани, противобактериальных и др. Таким образом, открываются широкие перспективы для лечебных препаратов пролонгированного влияния, причем коллаген или другие биополимеры играют для лекарственного средства роль депо. Так, введение коллагеновых препаратов, содержащих линкомицин, показало, что антибиотик сохраняется в окружающих тканях 23-25 суток. На этом принципе сейчас основаны лекарства с увеличенными сроками бактериального воздействия на микробную флору, применяющиеся при лечении остеомиелита, лейшманиозных язв, бронхиальных свищей, при пластике кровеносных сосудов в условиях инфекции.

Способность коллагена образовывать комплексы с гепарином – веществом, препятствующим свертыванию крови и возникновению тромбов, закупоривающих просвет сосуда, послужила основанием для создания сосудистого протеза с антикоагулянтными – противосвертывающими – свойствами. Такой комбинированный сосудистый протез представляет собою тканую или вязаную синтетическую трубку, поры которой заполнены коллагенгепариновой пленкой. Подобные имплантаты можно использовать для замещения не только пораженных артерий, но и пораженных вен, поскольку коллагенгепариновый комплекс длительно обеспечивает противосвертывающий эффект и препятствует образованию пристеночных тромбов.

Явным достоинством коллагена и полученных на его основе коллагеновых материалов для медицины является отсутствие токсических и канцерогенных свойств, слабая антигенность, высокая механическая прочность и устойчивость к тканевым ферментам, регулируемая скорость лизиса в организме, способность образовывать комплексы с биологически активными веществами, стимуляция регенерации собственных тканей организма.

Список литературы

1. В.В. Серов, А.Б. Шехтер – Соединительная ткань (функциональная морфология и общая патология) – М, 1981

2. Журнал структурной химии – С.П. Габуда, АА Гайдаш, В.А. Дребущак, С.Г. Козлова – Данные ЯМР о структуре связанной воды в коллагене с помощью сканирующей калориметрии – том 46, №6, 2005

3. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ – Л.В. Кухарева, Б.А. Парамонов, И.И. Шамолина, Е.Г. Семенова – Способ получения коллагена для лечения патологий тканей организма – СПб, 2003

4. Патент США 5106949, МПК A 61 K 35/32 – 1992 г.

5. Елисеев В.Г. Соединительная ткань. – М.: Медгиз, 1961.

6. Мазуров В.И. Биохимия коллагеновых белков. – М.: Медицина, 1974.

7. Никитин В.Н., Перский Е. Э» Утевская Л.А. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновых структур. – Киев.: Наукова думка, 1977.

8. Хилькин А.М., Шехтер А.Б., Истранов Л.П. Коллаген и его применение в медицине.‑М.: Медицина, 1976.

9. Bazin S., Lelous M., Delannay A. Collagen in granulation tissue. – Agent and Act., 1976, v. 6, p. 272–275

10. Bruns R. Supramolekular structure of polymorphic collagen fibrills. – J. Cell Biol., 1976, v. 68, p. 521–538

11. Gay S., Muller P., Meigel W., Kuhn K. Polymorphic des Kollagens: Neue Aspekte fur die Structur und Funktion des Bindegewebe.–Hautarzt, 1976, v. 27, p. 196–205

12. Gross J. Collagen biology: structure, degradation, and disease. – Harvey Lectures, 1974, v. 68, p. 351–432

13. Gross J. Aspects of the animal collagenases. – In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 275–317

14. Kefalldes N. Basement membranes: structural and biosynthetic considerations. – J. invest. Derm., 1975, v. 65, p. 85–92

15. Miller A. Molecular packing in collagen fibrils. – In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 85–136

16. Minor R., Clark C, Kefalides N. Synthesis and deposition of basement membrane procollagen. – J. Cell. Biol., 1975, p. 67, part 2, p. 287–899.

17. Piez K – The regulation of collagen fibril formation. – In: Extracellular matrix influences on gene expression. New York, 1975, v. 231–237.

18. Ratnachandran G., Ratnakrishnan C. Molecular structure of collagen. – In: Biochemistry of Collagen. New York, 1976, p. 45–84.

19. Reddi A. Collagen and cell differentiation. – In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 449–478

20. Trelstad R. Basement membrane collagens: isolation by heat gelation fractionation. – Upsala J. Med. Sci., 1977, v. 82, p. 157–162.

21. Weiss J. Enzymic degradation of collagen. – Intern. Rev. Connect. Tissue Res., 1976, v. 7, p. 101–157.

Характеристики

Список файлов реферата