90892 (679545), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Відносний вклад кожного з компонентів в сумарний вихідний струм варіював у різних клітин, але в більшості випадків величина їх залишалась в певних межах. Було встановлено, що близько 90% вихідного трансмембранного струму переноситься через потенціалкеровані К⁺ канали “затриманого випрямлення” та ТЕАчутливі ВК канали. В свою чергу, більш детальний вклад кожного компоненту до загального струму варіював наступних межах: 30 – 45% для Са²⁺незалежного К⁺ струму “затриманого випрямлення”, 40 – 50% для паксилінчутливого I_K(Ca), що переноситься через ВК канали, 5 – 15% для ТЕАчутливого I_K та 5 – 15% для d-ТКчутливого I_K(Ca), що переноситься через SК канали. Потрібно наголосити, що результати про процентний вклад кожного з вищеназваних компонент до загального вихідного струму, отримані за допомогою фармакологічного розділення, співпадали з результатами отриманими за допомогою віднімання окремих компонент вихідного струму.

Отриманні нами дані свідчать, що в ГМК taenia cаесi морської свинки окрім викликаних вихідних калієвих струмів можуть також виникати СВС. На сьогоднішній день аналогічні струми вже описані в багатьох ГМК: трахеї, різних відділах кишечнику та кровоносних судин (Шуба 1965, Bolton et al. 1996). Фізіологічна роль СВС, поки що достеменно невідома.

Велике зацікавлення викликає питання з приводу джерела Са²⁺ , необхідного для активації кожного зі згаданих раніше компонентів I_K(Ca). На сьогодні існує багато думок з цього приводу. Проведені нами досліди, а також отриманні раніше дані (Cole et al. 1989, Повстян та ін. 1997) наочно демонстрували, що амплітуда вихідного К⁺ струму, через наявність Са²⁺чутливої компоненти, сильно залежить від кількості Са²⁺, що входить до клітини через потенціалкеровані Са²⁺ канали під час деполяризуючого зміщення мембранного потенціалу. Блокування цих каналів іонами Со²⁺ призводило до значного пригнічення вихідного струму. Нездатність паксиліна пригнічувати вихідний струм в умовах блокування входу іонів Са²⁺ в клітину може слугувати доказом того, що для активації К_Са каналів великої провідності ГМК taenia caeci морської свинки необхідне значне підвищення [Са²⁺]_i в даному разі за рахунок входу іонів Са²⁺ ззовні через потенціалкеровані Са²⁺ канали L-типу. В той самий час, для активації SК потрібно незначне підвищення [Са²⁺]_i вище порогового рівня, як зазначалось раніше, близько 85 нМ (Vogalis, Goyal 1997).

В той же час було виявлено, що іони Ca²⁺, які спонтанно вивільняються з саркоплазматичного ретикулуму (СР), так звані Са²⁺ спарки, також можуть викликати активацію К_Са , при цьому активність каналів буде проявлятись у вигляді СВС (Bolton et al. 1996, Gordienko et al. 1998, Bayguinov et al 2001). Са²⁺ спарки призводять до локального підвищення [Са²⁺]_i, що в свою чергу призводить до активації невеликої кількості К_Са (10-100) (Бурый та ін. 1992, Benham et al. 1986), які генерують появу СВС. Лише суттєве вивільнення Са²⁺ з СР (викликане наприклад аплікацією кофеїну) може призвести до активації великої кількості К_Са каналів та викликати появу вихідного інтегрального макроструму (Гордиенко та ін. 1995, Повстян та ін. 2000). Однак в реальних умовах, подібне масове вивільнення Са²⁺ депо видається мало ймовірним.

В одній з недавніх робіт, що стосувалась вивчення впливу апаміна на іонні струми ізольованих ГМК ШКТ (Kong et al. 2000) було показано, що СВС можна розділити на два типи – великої та малої амплітуди. Перші блокувались харибдотоксином та утворювались завдяки активації ВК каналів, а другі − апаміном, і, відповідно формувались SК каналами. Проведені нами досліди показали, що паксилін ефективно блокував СВС великої амплітуди, при цьому частота СВС малої амплітуди майже не змінювалась, і, відповідно, не блокувались паксиліном. що узгоджується з наведеними даними. В той же час d –TK призводив до блокування СВС малої амплітуди, що може свідчити про те, що вони формуються за рахунок активації SК. ТЕА неселективний блокатор К⁺ каналів, на відміну від паксиліна, блокуючи СВС великої провідності також незначно пригнічував СВС малої амплітуди. Як було показано, на інтегральних струмах існує К⁺ провідність, яка нечутлива до паксиліну, але блокується ТЕА, і відповідно робить вклад в СВС малої амплітуди.

Підсумовуючи вище згадані дані, можна зробити висновок, що в ГМК taenia cаесi морської свинки існує щонайменше два компоненти I_K(Ca). Ці компоненти відрізняються між собою не лише провідністю каналів, через які вони переносяться, але і їх чутливістю до [Са²⁺]_i та змін мембранного потенціалу, а також відрізняються кінетичними характеристиками. Окрім наведеного вище, ці канали відрізняються чутливістю до блокаторів (d-TK, паксиліну, ТЕА). Так, d–TK виступає ефективним блокатором SК каналів ГМК ШКТ та може бути використаний, як інструмент для розділення та вивчення іонних струмів.

Локальне підвищення Са²⁺ виступає важливою ланкою в регуляції мембранного потенціалу, збудливості клітини та агоністіндукованих реакцій (Gordienko et al. 1998, Collier et al. 2000). Ці процеси є безпосереднім результатом вивільнення іонів Са²⁺ через ріанодинчутливі канали, або через ІР₃ активовані канали на саркоплазматичному ретикулумі. В деяких клітинах, локальне вивільнення Са²⁺ може призводити до утворення так званої Са²⁺ хвилі, що може розповсюджуватись навколо місця ініціації та через всю клітину (Gordienko et al. 1998, Jaggar et al. 2000). Локальне вивільнення Са²⁺ в безпосередній близькості до плазматичної мембрани, викликає просторово обмежене збільшення концентрації останнього, що сягає 1 мкМ (Perez et al. 1999). Таке локальне підвищення [Са²⁺]_i активує Са²⁺залежні іонні канали, що розташовані поблизу місця вивільнення іонів Са²⁺. Тому головним зв’язуючим ланцюгом між вивільненням Са²⁺ та клітинною відповіддю, виступає активація іонної провідності в плазматичній мембрані.

Активація вихідного калієвого струму відповідає за генерацію неадренергічних нехолінергічних гальмівних синаптичних потенціалів (НАНХ ГСП). На сьогоднішній день загальноприйнята думка, що АТФ, так само як і NO, виступає медіатором гальмівної нейропередачі в ШКТ (Шуба та ін. 1998, Shuba et al.2003, Moore et al. 1990). В taenia cаесi морської свинки стимуляція НАНХ-нейронів призводила до генерації двофазного ГСП (И.А. Владимирова та ін. 1984,1993). Повільний компонент цього ГСП блокується інгібіторами NO-синтази та харибдотоксином, блокатором BК каналів (Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003, Загороднюк та ін. 1994), а швидкий – антагоністом пуринорецепторів суруміном, та блокатором SК каналів апаміном (Владимирова та ін. 1986, Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003). Проведені нами досліди по вивченню впливу АТФ на поодинокі ГМК taenia cаесi морської свинки показали, що АТФ (100 мкМ) при підтримуваному потенціалі в –40 мВ, призводив до значного приросту СВС малої амплітуди. При цьому частота СВС великої амплітуди сильно не змінювалась. Як було вказано раніше, СВС малої амплітуди формуються здебільшого за рахунок активації SК каналів. Прикладення d-TK, як блокатора SК каналів, призводило до значного пригнічення СВС малої амплітуди, та усунення впливу АТФ. Це збігається з існуючими даними на багатоклітинних препаратах, уявленнями та літературними даними (Bayguinov et al. 2000, Shuba et al. 2003). Для встановлення джерела кальцію, що задіється в цих процесах було використано мембраннопроникний антагоніст ІР₃ рецепторів – 2-аміноетоксидифеніл борат (2-АРВ) (Maruyama et al. 1997). Преінкубація клітин в розчині з 2-АРВ (30 мкМ) не призводила до суттєвих змін СВС, активованих вивільненням Са²⁺ з ріанодинових депо. В той же час ефект збільшення частоти СВС при аплікації АТФ був відсутній. Дослідження, проведені на багатоклітинних препаратах показували, що 2-АРВ пригнічував ГСП, викликані інтрамуральним подразненням у препаратах caecum та colon, а також АТФ та НА – викликану гіперполяризацію (Shuba et al. 2003). Це дає можливість зробити висновок, що вивільнення Са²⁺ з ІР₃чутливого кальцієвого депо виступає проміжною ланкою в передачі між P2Y рецепторами і активуванням К_Са каналів малої провідності, які приймають участь у генерації апамінчутливого ГСП.

АТФ, як гальмівний нейромедіатор, взаємодіє у гладеньких м’язах з P2Y рецепторами, котрі відносяться до групи метаботропних рецепторів. Ці рецептори зв’язані з внутрішньоклітинними G-білками (G_q/11) завдяки яким активують фосфоліпазу С (Kьgelgen et al. 2006). Для визначення ролі фосфоліпази С у генерації АТФ-індукованої відповіді, було використано інгібітор фосфоліпази С – U73122 (Smith et al. 1990). За таких умов, додавання АТФ на фоні U73122 (5 мкМ) не призводило до зміни частоти появи СВС, як великої так і малої амплітуди. На багатоклітинних гладеньком’язових препаратах caecum (Shuba et al. 2003), застосування U73122, призводило до зменшення амплітуди ГСП, викликаного інтрамуральним подразненням, у порівнянні з тестовим майже на 50%. Наступне додавання апаміну, блокатора К_Са малої провідності, призводило до повного блокування ГСП, та появи нехолінергічних збуджуючих синаптичних потенціалів.

Наведені дані дозволяють припустити, що пуринергічна активація СВС є результатом локального вивільнення іонів Са²⁺ із саркоплазматичного ретикулуму, внаслідок активації P2Y рецепторами фосфоліпази С та задіяного нею інозитолтрифосфатного механізму.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою метода фіксації потенціалу було показано, що вихідний трансмембранний іонний струм ГМК taenia caeci морської свинки має три складові: потенціалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти Са²⁺залежного К⁺ струму.

2. Вихідний калієвий струм на 50% блокується неселективним блокатором ВК каналів ТЕА (1мМ), та на 40% − селективним блокатором ВК каналів паксиліном (100 нМ).

3. Близько 10% вихідного калієвого струму пригнічується блокатором нікотинових холінорецепторів та К_Ca каналів d-ТК в концентрації 50 мкМ.

4. Спонтанні вихідні струми (СВС) за своїми ознаками можна розділити на струми малої та великої амплітуди. СВС великої амплітуди чутливі до паксиліну та ТЕА. Це вказує, що вони переносяться через ВК канали. СВС малої амплітуди чутливі до дії d-ТК, що свідчить про активацію SК каналів.

5. Блокатор ІР₃ рецепторів 2-АРВ (30 мкМ) пригнічує частоту СВС малої амплітуди та не впливає на СВС великої амплітуди. Це свідчить, що результатом виникнення СВС малої амплітуди є вивільнення Са²⁺ з ІР₃чутливого Са²⁺ депо міоцитів.

6. Активація пуринорецепторів шляхом прикладення АТФ (100 мкM) супроводжується значним приростом частоти СВС малої амплітуди, що обумовлено активацією SК каналів чутливих до дії d-TK.

7. АТФ в присутності селективного блокатора фосфоліпази С U73122 (5 мкМ) не впливає на частоту та амплітуду СВС

8. АТФ-індукований Са²⁺ залежний калієвий струм в міоцитах taenia caeci обумовлений залежним від фосфоліпази С збільшенням внутрішньоклітинного рівня ІР₃, та наступним вивільненням Са²⁺ з ІР₃ чутливого депо міоцитів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Nessin V.V. Purenergic activation of the cationic conductivity in the guinea pig // Нейрофізіологія/Neurophysiology – 2003. – T.35, № 3/4, – C. 361.

2. Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. d-тубокураринчутливий компонент кальційзалежного калієвого струму в міоцитах taenia coli морської свинки // Нейрофізіологія/Neurophysiology – 2005. – Т.37, № 3, – С. 271-276. (Всі електрофізіологічні дослідження, обробка експериментального матеріалу та написання статті виконано особисто автором).

3. Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. Характеристики паксилінчутливого кальційзалежного калієвого струму ізольованих міоцитів кишечнику, Нейрофізіологія/Neurophysiology – 2007. – Т.39, № 3, – С. 201-207. (Всі електрофізіологічні дослідження, обробка експериментального матеріалу та написання статті виконано особисто автором).

4. Кришталь Д.О., Несін В.В., Шуба М.Ф. Модуляція калієвого струму А-типу в гладеньком’язових клітинах vas deferens щура кальцій/кальмодулінзалежною протеїнкіназою ІІ // Нейрофизиология/Neurophysiology. – 2007. – Т.39, № 4/5, – С. 419-422. (Приймав участь у обробці експериментального матеріалу, узагальненні та обговоренні результатів досліджень).

5. Кришталь Д.О., Несін В.В., Шуба М.Ф. Дія паксиліну на кальційзалежний калієвий струм в ізольованих гладеньком’язових клітинах сім’явивідних протоків щура // Фізіологічний журнал. – 2007. – Т. 53, № 5, - С. 67-74. (Автор приймав участь у обробці експериментального матеріалу та написанні статті).

Тези доповідей

1. Nessin V.V. Purenergic activation of the spontaneous transient outward current in the guinea pig taenia coli // Abstract book of IBRO Advanced School of Neuroscience “Receptor, Channels, Messengers”, Yalta, September 16-28, 2004.

2. Несін В.В. Властивості спонтанних вихідних струмів, викликаних пуринергічною активацією міоцитів кишечнику морської свинки // Матеріали міжнародної конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”, приуроченої до 80-ліття з дня народження проф. І.В.Шостакової. – С. 55. Львів, 7–9 жовтня 2004.

3. Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. Властивості катіонного струму активованого АТФ у міоцитах кишечнику морської свинки // Матеріали І Української наукової конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики ” – С. 124. Харків, 20-22 вересня 2004.

4. Несін В.В. Вплив d-тубокурарину на кальційзалежний калієвий струм в ізольованих гладеньком’язових клітинах кишечнику // Матеріали міжнародної наукової конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем”, приуроченої до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету ім. Івана Франка. – С. 107. Львів, 8-11 листопада 2006.

5. Несін В.В. Властивості паксилінчутливої компоненти кальційзалежного калієвого струму ізольованих гладеньком’язових клітинах кишечнику // Матеріали 4-го з’їзду Українського біофізичного товариства – С. 79. Донецьк, 19-21 грудня 2006.

АНОТАЦІЇ

Характеристики

Список файлов реферата