90690 (679400), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Виділення фрагментованої ДНК та її електрофорез у гелі агарози. Клітини після культивування із препаратами АТ осаджували центрифугуванням при 2000 об/хв протягом 5 хв. До осаду клітин додавали 0,5 мл холодного ЗФР та фіксували, поступово додаючи до суспензії клітин 5 мл холодного розчину 70% етанолу. Клітини залишали на 12 год при - 20 °С (деякі зразки зберігали при даній температурі протягом 3-4 тижнів). Після цього клітини центрифугували при 2000 об/хв протягом 5 хв. Осад клітин (2-3 млн. клітин) ресуспендовували у 40 мкл фосфат-цитратного буферу, який містив 192 частини 0,2 М Na2HPO4 та 8 частин 0,1 М лимонної кислоти, рН 7,8, та залишали при кімнатній температурі на 30 хв. Після центрифугування при 3000 об/хв протягом 5 хв надосадову рідину переносили у свіжу пробірку типу Еппендорф та додавали 3 мкл 0,25% водного розчину NP-40 („Sigma”, США) та 2 мкл РНК-ази А (розчин 10 мг/мл у воді). Після 1-годинної інкубації при 37 °С до суспензії додавали 5 мкл протеїнази К („Merck”, Німеччина) (розчин 1 мг/мл у воді) та інкубували 1 год при 37 °С. Після інкубації до препарату ДНК додавали 12 мкл буферу, який містив 0,25% бромфенолового синього, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50% гліцерину і розділяли в 1% гелі агарози у присутності 0,005% етидію броміду при напрузі 4 В/см протягом 2 год. Фрагменти ДНК виявляли при ультрафіолетовому освітленні і фотографували цифровою камерою Nikon Coolpix 4200.
Мікроелектрофорез ДНК окремих клітин у гелі агарози (метод ДНК-комет). Аналіз здійснювали, як описано (Камінський та ін., 2005). Для формування гелю, предметні скельця покривали плівкою агарози шляхом нанесення 2 мл 1% тугоплавкої агарози („Serva”, Німеччина) і висушування у термостаті при 37 °С.40 мкл суспензії клітин вносили у пробірку типу Еппендорф і поміщали у водяну баню при 40 °С, змішували із 120 мкл розчину легкоплавкої агарози („Serva”, Німеччина) (кінцева концентрація агарози становила 0,75%), швидко наносили на теплі предметні скельця 150 мкл такої суміші і покривали теплим покривним скельцем. Після застигання агарози обережно знімали покривне скельце і вносили у лізувальний буфер (2% лаурил саркозинат, 0,5 М ЕДТА, рН 7,5, 0,3 мг/мл протеїнази К). Гелі інкубували при 4о С упродовж 1 год, а потім 20 год при 37 °С. Гелі витримували тричі по 20 хв у буфері ТБЕ (90 мМ трис, 90 мМ борної кислоти та 2 мМ ЕДТА, рН 8,5), після чого вносили в електрофоретичну камеру і заливали цим же буфером (2-3 мм буферу над скельцем). Електрофорез здійснювали при напрузі 0,6 В/см протягом 25 хв, причому електричне поле скеровували поперек предметного скельця. Після лужного електрофорезу препарати нейтралізували у 0,4 М трис-HCl, рН 7,5. Гелі висушували і фарбували водним розчином етидію броміду у концентрації 2 мкг/мл.
Комп’ютерний аналіз рівня гомології послідовностей амінокислот імуноглобулінів і рецептора СD4 та протеїнкіназ. Амінокислотну послідовність рецептора СD4 та Fc-фрагментів імуноглобулінів було отримано із бази даних Swiss-Prot. Для аналізу рівня гомології використовували банк генів протеїнкіназ KinBase та програми порівняння Kinom Blast Server (www. kinase. com). Аналіз доменної організації рецептора СD4 проводили, використовуючи базу даних SMART (smart. embl-heidelberg. de) та Pfam (pfam. wustl. edu). Пошук функціональних мотивів молекули СD4 здійснювали, застосовуючи базу даних Scansite та програму порівняння Motif Scan (scansite. mit. edu).
Статистична обробка отриманих результатів досліджень. Усі досліди повторювали 3-5 разів. У роботі наведено середні значення величин і стандартні похибки (M±m). Статистичний аналіз проводили, користуючись критерієм Ст’юдента (t). Вірогідними вважали дані у випадку, коли р≤0,05. Побудову графіків та статистичну обробку даних здійснювали за допомогою комп’ютерних програм Origin 4.0 та Excel 97.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вплив препаратів антитіл сироватки крові та молока людини на ріст і виживання Т-клітин лінії Jurkat. Аналіз впливу препаратів сумарних імуноглобулінів (Ig), отриманих із сироватки крові 22 хворих на розсіяний склероз (РС), і 25 зразків молозива клінічно здорових породіль, отриманих осадженням 50% cульфатом амонію, показав, що залежно від донорів, ці препарати можуть як пригнічувати, так і стимулювати ріст Т-клітин лінії Jurkat in vitro (рис.3). На відміну від Ig хворих на розсіяний склероз, препарати Ig, отримані із сироватки крові здорових донорів, у більшості випадків пригнічували ріст клітин in vitro. Рівень гальмування приросту Т-клітин лінії Jurkat під дією Ig здорових донорів був близьким до рівня гальмування приросту цих клітин під впливом Ig хворих на розсіяний склероз. При цьому жоден із 25 препаратів Ig здорових донорів не володів промітогенною активністю щодо Т-клітин лінії Jurkat. Співвідношення кількості живих і мертвих клітин у цьому досліді вказує на те, що деякі препарати Ig молозива породіль володіють цитотоксичною активністю щодо Т - клітин лінії Jurkat.
Гель-електрофорезом індивідуальних клітин (аналіз ДНК-комет), а також електрофоретичним аналізом міжнуклеосомної фрагментації ядерної ДНК встановлено, що загибель Т-клітин лінії Jurkat під впливом цитотоксичних препаратів Ig молозива породіль відбувається шляхом апоптозу (рис.4).
Наступне дослідження показало, що подібно до Ig молозива породіль, окремі препарати Ig, очищені із сироватки крові хворих на розсіяний склероз і здорових донорів, також індукують апоптоз цих Т-клітин.
Отримані результати вказують на особливості впливу препаратів імуноглобулінів на ріст і виживання Т-клітин лінії Jurkat, що може відображати індивідуальний стан гуморального імунітету донорів. Відмінності у дії препаратів Ig щодо клітин можуть бути пов’язані із присутністю в їхньому складі ауто-АТ певної антигенної специфічності і каталітичної активності. Особливої уваги заслуговує той факт, що досліджені препарати сумарних АТ сироватки крові хворих на розсіяний склероз і АТ молозива пророділь володіли як цитотоксичною, так і промітогенною активністю щодо Т-клітин лінії Jurkat. Ці дані вказують на те, що у молозиві людини можуть бути присутні ауто-АТ, які за своєю антигенною специфічністю і біологічною активністю подібні до ауто-АТ сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання.
Ауто-АТ молозива клінічно здорових породіль. Характерною ознакою аутоімунних порушень в організмі людини є поява високоспецифічних ауто-АТ до ядерних антигенів – дволанцюгової ДНК та гістонів. За допомогою ІЕА було проаналізовано 25 препаратів Ig молозива породіль на наявність у них анти-ДНК АТ та анти-гістонових АТ. Як позитивний контроль застосовували препарати IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз, а як негативний – препарати IgG сироватки крові здорових донорів. Встановлено, що вміст анти-ДНК АТ в усіх препаратах Ig молозива породіль, окрім препарату Ig № 4, суттєво не відрізнявся від вмісту анти-ДНК АТ у препаратах IgG, виділених із сироватки крові здорових донорів (рис.5). Вміст анти-ДНК АТ у препараті № 4 був достовірно вищим, ніж в інших препаратах АТ, хоча у цілому, він був нижчим, ніж у препаратах IgG, виділених із сироватки крові хворих на розсіяний склероз.
Анти-гістонові АТ було виявлено у складі 12-ти препаратів Ig молозива породіль (Рис.5). При цьому у 6-ти препаратах їхній рівень був близьким або перевищував рівень анти-гістонових АТ, виявлених у препаратах IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз. Найвищим вмістом анти-гістонових АТ характеризувався препарат № 4, де рівень анти-гістонових АТ у 2,5 рази перевищував їхній рівень у препаратах IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз.
Додатковим підтвердженням наявності ауто-АТ у молозиві породіль можуть слугувати дані аналізу субклітинної локалізації антигенів секреторних імуноглобулінів А (sIgA) у фіксованих препаратах клітин. За допомогою FITC-мічених АТ, специфічних до IgA людини, було виявлено, що препарати сумарних імуноглобулінів молока містять sIgA-антитіла зі спорідненістю до антигенів Т-клітин лінії Jurkat. На Рис.6 представлено узагальнені результати
аналізу, які вказують, що за спорідненістю до антигенів клітин і місцем їхньої локалізації sIgA-антитіла можна розділити на три типи: ауто-АТ із високою спорідненістю до ядерних антигенів (ряд 1), ауто-АТ із низькою спорідненістю до антигенів клітин (ряд 2) і ауто-АТ із високою спорідненістю до компонентів цитоплазми і плазматичної мембрани цих клітин (ряд 3).
У цілому, аналіз отриманих даних свідчить про те, що у молозиві клінічно здорових породіль, як і у сироватці крові хворих на деякі аутоімунні захворювання, можуть бути присутні ауто-АТ. Це дозволяє припустити, що у молозиві жінок-породіль, подібно до сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання, можуть бути присутні ауто-АТ із цитотоксичною і промітогенною активністю щодо клітин ссавців. Для перевірки цього припущення із молозива породіль виділяли анти-ДНК sIgA і досліджували їхні функціональні властивості.
Характеристика функціональної активності анти-ДНК АТ молока породіль. Анти-ДНК sIgA виділяли хроматографією на ДНК-целюлозі (рис.7А) з електрофоретично гомогенних препаратів sIgA, очищених із молока клінічно здорових породіль афінною та іонобмінною хроматографіями, як вказано на схемі, представленій на рис.1. Наявність sIgA у фракції білків, очищених на
ДНК-целюлозі було підтверджено Ds-Na-eлектрофорезом у градієнті ПААГ і імуноблотингом із використанням специфічних антитіл до IgA людини (рис.7Б).
Нуклеазна активність анти-ДНК sIgA молока людини. Характерною ознакою анти-ДНК АТ сироватки крові хворих на СЧВ (Shuster et al., 1990) і розсіяний склероз (Nevinsky et al., 2002) є їхня гідролізуюча активність щодо плазмідної ДНК. Під час аналізу нуклеазної активності анти-ДНК sIgA субстратами реакції слугували: рибосомна РНК клітин аденокарциноми лінії L929, надспіралізована і лінійна форми ДНК плазміди. Виявлено, що анти-ДНК sIgA, очищені із жіночого молозива, подібно до анти-ДНК АТ сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання, володіють РНКазною, топоізомеразною та ендонуклеазною активністю (рис.8). Нуклеазна активність анти-ДНК sIgA, отриманих із молока жінок у такий же спосіб, була незалежно від нас виявлена іншими дослідниками (Nevinsky, 2000).
На наступному етапі дослідження проведено пошук чинників, які можуть впливати на нуклеазну активність анти-ДНК sIgA. Встановлено, що 10 мкМ АТР суттєво інгібує гідроліз рРНК клітин аденокарциноми людини А549 і одноланцюгове розщеплення надспіралізованої форми ДНК плазміди. dATP у такій же концентрації не виявляв помітного впливу на РНКазну і топоізомеразну активність sIgA-абзимів. Іншу картину спостерігали при дослідженні впливу рибонуклеотидтрифосфатів (NTP) і дезоксирибонуклеотидтрифосфатів (dNTP) на ендонуклеазну активність анти-ДНК sIgA. На відміну від РНКазної і топоізомеразної активності, ендонуклеазна активність анти-ДНК sIgA-абзимів, крім АТР, повністю інгібувалася і dATP. При цьому GTP, CTP, TTP також суттєво інгібували реакцію гідролізу лінійної форми плазмідної ДНК. Часткове інгібування ендонуклеазної активності анти-ДНК sIgA молока людини спостерігалося у присутності dGTP, хоча dCTP dTTP не впливали на швидкість розщеплення ДНК плазміди.
Вибірковість дії нуклеотидтрифосфатів на РНКазну, топоізомеразну й ендонуклеазну активність sIgA-абзимів вказує на те, що в основу регуляції їхньої активності можуть бути задіяні, щонайменше, два незалежних механізми. За першим механізмом, регуляція нуклеазної активності може відбуватися шляхом фосфорилювання поліпептидів sIgA за участю sIgA-абзимів, які володіють протеїнкіназною активністю (Kit et al., 1991, 1995). Можливо, що фосфорилювання певних ділянок цих антитіл призводить до втрати їхньої спорідненості до нуклеїнових кислот, зокрема до рРНК. За другим механізмом, інгібування ендонуклеазної активності ДНК-гідролізуючих sIgA може відбуватися через зміну конформації каталітичного центру абзимів при зв’язуванні АТР і dATP із певними ділянками поліпептидів цих антитіл, задіяних в алостеричній регуляції їхньої нуклеазної активності.
Про можливе існування цих ділянок у sIgA-абзимів свідчать результати аналізу спорідненості щодо олігонуклеотидів і АТР електрофоретично гомогенних препаратів sIgA, отриманих із молока людини послідовними хроматографіями на протеїн А-сефарозі і ДЕАЕ-фрактогелі (рис.9). Очищені у такий спосіб sIgA слугували основою для подальшої очистки АТ, які володіють фосфотрансферазною і нуклеазною активністю.
За допомогою афінної модифікації sIgA-антитіл 32Р-міченими алкілуючими похідними олігонуклеотидів і АТР у присутності конкурентів (dT14 і АТР) встановлено, що секреторний компонент sIgA виявляє спорідненість до дезоксирибоолігонуклеотидів (рис.9, доріжки 3, 4), тоді як важкі і легкі ланцюги цих антитіл, головним чином, зв’язуються із АТР (рис.9, доріжки 5, 6).
На основі цього аналізу було зроблено припущення про те, що подібно до інгібувальної дії АТР на нуклеазну активність sIgA-абзимів, олігонуклеотиди можуть бути залучені до регуляції протеїнкіназної активності sIgA-абзимів молозива породіль. Підтвердженням цього припущення слугувало дослідження впливу олігонуклеотидів на протеїнкіназну активністю анти-ДНК sIgA молозива породіль.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
