90263 (679103), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Сложные механизмы регуляции размножения HIV действуют не в изоляции: они тесно связаны с метаболизмом клетки-хозяина. Начать с того, что вирус использует клеточный аппарат для транскрипции своих генов и синтеза белков. В частности, клеточные факторы явно играют роль во вспышке репликации HIV, происходящей при участии гена tat, когда зараженная Т-клетка стимулируется антигеном. Особенности молекулярного “климата” клетки-хозяина также, вероятно, как-то влияют на скорость размножения вируса, которая различна в различных типах клетки.
Возможно, для связи клеточных и вирусных процессов имеет значение связь клеточных белков с LTR в начале вирусного генома. Последовательности в LTR определяют сайт инициации транскрипции вирусных генов - стартовую точку, в которой начинается синтез мРНК. По крайней мере восемь белков, которые в норме участвуют в клеточной транскрипции, связываются с клеточной ДНК в сайте инициации транскрипции или рядом с ним. Они играют определенную роль в процессе транскрипции. Один из белков, который узнает инициаторные последовательности, играет специфическую роль в Т-клетках и других лимфоцитах. Этот белок активируется, когда лимфоцит стимулируется антигенами и начинает размножаться. Считается, что он способствует размножению клетки, усиливая транскрипцию. Как выяснилось, при стимуляции зараженных Т-клеток усиливается связывание этого белка с геномом провируса. Таким образом активация этого белка может быть одним из путей ускорения размножения HIV при стимуляции Т-клетки.
Вероятно, набор клеточных факторов, действующий на вирусный геном, варьирует в зависимости как от условий, так и от типа клетки-хозяина. Некоторые клетки, находясь в состоянии покоя. Могут просто не иметь белков, необходимых для инициализации транскрипции, так что инфекция остается скрытой. В других клетках скорость размножения вируса может быть ограничена из-за низкой концентрации инициаторных факторов или из-за избытка белков, ингибирующих синтез мРНК. Таким образом, клетка-хозяин при помощи собственных факторов транскрипции создает молекулярное окружение, влияющее на регуляторные механизмы HIV.
После того как в результате действия описанных выше механизмов началось производство вирусных частиц, в игру вступает последний ген. Этот ген, названный vif (от англ. virion infectivity factor - фактор инфекционности вириона), кодирует небольшой белок, который обнаруживается в цитоплазме зараженных клеток и вокруг них в межклеточной среде, а так же в свободных вирусных частицах. Белок - продукт гена vif каким-то образом усиливает способность отпочковавшегося вириона заражать другие клетки. У штаммов HIV с мутациями, инактивирующими vif, вирионы имеют нормальный вид, содержат полный набор РНК и ферментов, но заражают клетки намного менее эффективно.
3. Этапы заражения клетки вирусом СПИДа
Первый шаг любой вирусной инфекции - связывание вирусной частицы с компонентом мембраны заражаемой клетки. Для HIV роль такого рецепторного компонента играет белок, называемый антигеном CD4.(Антиген - это молекулярная структура, которая узнается антителом.) из этого следует, что распределение CD4 в организме должно соответствовать тропизму HIV, т.е. спектру клеток и тканей, поражаемых вирусом. Антиген CD4 встречается главным образом на лимфоцитах, называемых Т-4 хелперами, которые являются важным элементом иммунной системы, а так же на некоторых других клетках.
Как было установлено, связывание происходит, если CD4 взаимодействует с белком оболочки вируса gp120, который распределен на внешней поверхности мембраны. Удалось определить специфические фрагменты молекул CD4 и gp120, участвующие в связывании. Эти результаты открывают возможность двойной борьбы с HIV: препятствовать взаимодействию вируса с клеточным рецептором CD4 можно блокируя сам рецептор или экранируя вирусный белок gp120.
Вследствие поражения клеток крови, несущих антиген CD4, особенно Т-4 лимфоцитов, по его концентрации можно судить о зараженности СПИДом. В клеточных культурах можно так же наблюдать еще один весьма удобный для исследования признак заражения - образование многоядерных синцитиев. Синцитий представляет собой гигантскую клетку, содержащую множество ядер внутри одной мембраны. Он формируется в результате слияния клеток, зараженных HIV, со здоровыми клетками, несущими молекулы рецептора.
Наиболее строгое доказательство такого механизма взаимодействия вируса с клеткой стал эксперимент, проведенный в 1984 г. в Колумбийском университете США. Удалось перенести ген, кодирующий CD4, в клетки HeLa - линию клеток раковой опухоли шейки матки. Эти клетки не содержат CD4 и в норме не заражаются HIV. Тогда как измененные клетки HeLa, несущие CD4, могут быть заражены HIV, после чего они быстро сливаются в гигантские синцитии.
Этот эксперимент дал, кроме того, один неожиданный результат, который до сих пор полностью не объяснен. Человеческий ген CD4 был введен в мышиные Т-клетки, которые тем самым приобрели способность производить соответствующий белок. Частицы HIV связывались с этими измененными клетками, однако признаков инфекции не было: не образовывался ни синцитий, ни инфекционные вирусные частицы. Это было удивительно, так как мышиные клетки вообще-то способны поддерживать размножение HIV при некоторых условиях. По всей видимости, мышиные клетки не могут быть заражены частицами HIV даже в присутствии рецепторов HIV. К заражению мышиных клеток оказались также неспособны некоторые родственные вирусы. Эти факты позволяют предполагать, что необходим еще какой-то компонент клеточной поверхности для того, чтобы вирус, прикрепившийся к клеточной мембране смог проникнуть внутрь клетки. Природа такого дополнительного фактора пока не ясна.
Связывание вирусного gp120 с клеточным CD4 - это только первый этап проникновения вируса в клетку. Последующие этапы пока менее понятны. Например, как попадает в клетку вирусный генетический материал? Простейшая и наиболее вероятная возможность состоит в том, что оболочка вириона сливается с клеточной мембраной и содержимое вирусной частицы (включая генетический материал) оказывается внутри клетки. Другой возможный путь - эндоцитоз, т.е. образование небольшого впячивания клеточной мембраны, которое затем отпочковывается внутрь, превращаясь в замкнутый мембранный пузырек. Пузырек полностью окружает вирусную частицу и переносит ее внутрь клетки. Там мембрана, образующая пузырек (теперь он называется эндосомой), закисляется. Это приводит к конформационным изменениям, слиянию ее с вирусной мембраной и освобождению содержимого вирусной частицы во внутриклеточное пространство.
Независимо от того, что на самом деле происходит - прямое слияние или эндоцитоз - вирусная мембрана должна претерпеть слияние с клеточной. Как же это осуществляется? Согласно одной из гипотез, представляющейся вполне правдоподобной, связывание gp120 с CD4 вызывает изменение конформации белка gp120, вследствие чего обнажается часть другого белка оболочки, gp41, в норме скрытого под молекулой gp120. Эта область gp41 гидрофобна и потому должна внедряться в мембрану, а не оставаться снаружи, в водной среде, окружающей клетку. Оказавшись открытой, гидрофобная область gp41 взаимодействует с близлежащей частью клеточной мембраны и индуцирует ее слияние с вирусной мембраной. Пока не ясно, нужен ли для связывания с gp41 еще какой-то рецептор клеточной поверхности, помимо CD4, или же gp41 сам внедряется прямо в клеточную мембрану.
После того, как HIV проник в клеточную среду и его генетический материал интегрировался в клеточный геном, он может оставаться неактивным и никак себя не обнаруживать, а может и проявиться одним из трех способов.
Во-первых, вирусный геном может вызвать персистирующую инфекцию; при этом образуется некоторое количество вирусных частиц, но клеток погибает немного. Во-вторых, инфекция может привести к образованию синцития, который вскоре гибнет. Появление синцитиев - главный результат воздействия HIV на культуру клеток. В организме зараженного человека синцитии иногда можно наблюдать на поздних стадиях инфекции *особенно в мозге). Неясно, однако, играют ли они какую-то роль в раннем патогенезе СПИДа.
Третий вероятный результат заражения HIV - быстрая гибель клеток без образования синцитиев. Каким образом HIV убивает клетки пока не ясно. Возможно, какие-то из продуктов, кодируемых генами HIV, обладают прямым токсическим действием. Возможно, также разрушение клеточной мембранной системы из-за того, что внедрившийся в нее gp120, синтезированный в результате инфекции, взаимодействует с имеющимся в мембране CD4. Судьба зараженной клетки зависит и от иммунного ответа, поскольку иммунная система способна узнавать вирусные белки на поверхности зараженных клеток и убивать эти клетки.
Распределение зараженных HIV клеток в организме обусловлено главным образом тем, как распределены клетки, несущие CD4. Изначально этот антиген был идентифицирован по его присутствию на определенных Т-лимфоцитах. И действительно, его нормальные функции, по-видимому, в основном связаны со сложной сетью взаимодействий между клетками иммунной системы.
Т-лимфоциты, несущие CD4, способны взаимодействовать с клетками, представляющими антигены. Эти последние находят чужеродные антигены и экспонируют их на своей клеточной мембране вместе со специфическими белками - гликопротеинами MHC класса II (от англ. Major Histocompatibility Complex - главный комплекс гистосовместимости). Когда Т4-хелперы узнают комбинацию антигена и гликопротеина MHC класса II, они инициируют иммунный ответ против чужеродных или зараженных клеток, несущих этот антиген. Считается, что взаимодействие между антигенами CD4 на Т-клетках и гликопротеинами MHC класса II на клетках, представляющих антиген, важный элемент контакта этих клеток.
Как сейчас известно, Т-лимфоциты не единственные клетки со встроенным в мембрану антигеном CD4. Не менее 40% моноцитов периферической крови (эти клетки являются предшественниками макрофагов - клеток-“мусорщиков”) и некоторые клетки, представляющие антиген в лимфатических узлах, коже и других органах, а также примерно 5% всех В-клеток организма (эти клетки производят антитела) несут CD4 и могут быть заражены HIV.
Но некоторые виды клеток заражаются HIV в культуре, а прямо выделить в них CD4 не удается. К ним относятся глиальные клетки головного мозга, клетки ряда злокачественных опухолей мозга, а также определенные линии клеток из раковых опухолей кишечника. Однако, хотя эти клетки и не производят CD4 в экспериментально определимых количествах, они содержат немного информационной РНК, кодирующей белок CD4, а значит, способны синтезировать и сам CD4. По-видимому, для заражения HIV достаточно даже очень малого количества CD4.
4. Препараты, противостоящие СПИДу
Всякое терапевтическое средство против инфекции независимо от природы патогена - будь то вирус, бактерия, грибок или простейшее - должно либо вызывать гибель патогена, либо прекращать его размножение. При этом препарат не должен причинять существенного вреда зараженному организму. Как правило, такие лекарства выполняют свою задачу, действуя на биохимические процессы, характерные только для патогена. В случае бактерий это достигается сравнительно просто, так как по структуре и метаболизму клетки бактерий и клетки организма млекопитающего сильно различаются. Например, пенициллин нарушает синтез клеточной стенки бактерий, а на клетки млекопитающих, у которых нет такой стенки, он не действует.
С вирусами ситуация гораздо сложнее. Вирусы представляют собой просто генетический материал, одетый в оболочку из гликопротеинов и липидов. Они не способны размножаться самостоятельно и вместо этого заражают клетки другого организма и узурпируют их аппарат биосинтеза, который и обеспечивает воспроизведение вируса. Когда происходит активная репликация вируса, часто бывает трудно различить вирусные белки, взаимодействующие с клеткой и белки самой клетки. Тесная связь многих этапов жизненного цикла вируса с метаболизмом клетки-хозяина затрудняет создание препаратов, которые избирательно подавляют репликацию вируса и в тоже время минимально воздействуют на клетку.
Существенно также, что практически любой препарат (в том числе и пенициллин) обладает в той или иной степени побочным действием и токсичностью. Поэтому всегда необходимо учитывать не только эффект воздействия на патоген, но и вред, причиняемый организму человека. Важнейшей характеристикой потенциального терапевтического препарата является его “терапевтический индекс”: отношение токсичной дозы к эффективной дозе. Однако в случае болезней , представляющих угрозу для жизни, таких как СПИД, допустимо использовать и препараты со сравнительно низкими значениями терапевтического индекса по меньшей мере, пока не созданы более совершенные.
Сложный жизненный цикл позволяет HIV заражать клетки иммунной системы и ускользать от их действия. Но для борьбы с инфекцией такая сложность может быть не только бедствием, но и благом, поскольку она предоставляет много возможностей для воздействия противовирусных средств.
Первая стадия - связывание вируса с клеткой (см. выше). Существует несколько возможностей подавлять этот процесс. Можно получить антитела, которые взаимодействуют с соответствующей частью оболочки вируса и тем самым нейтрализуют способность gp120 связываться с CD4. Можно соединить такие антитела с молекулами какого-либо токсина, тогда они, связываясь с зараженными клетками, например с макрофагами, содержащими вирус и производящими его белки, будут убивать их. Можно получить и антитела к CD4, но этот подход потенциально опасен, потому что такие антитела будут атаковать и здоровые клетки иммунной системы организма. Поэтому исследования направлены главным образом на получение антител к gp120.
Получить эффективные антитела, нейтрализующие gp120, по ряду причин трудно. Не все антитела против gp120 будут блокировать ключевой участок связывания с CD4. У больных, в организме которых в процессе нормальной реакции на инфекцию HIV образуются нейтрализующие антитела (обычно лишь в малом количестве), СПИД тем не менее развивается. Определенного разрешения этой проблемы пока нет. Возможно одна из причин - высокая скорость мутирования HIV. У некоторых возникающих в организме вариантов вируса может быть изменен гликопротеин оболочки, и он не будет нейтрализовываться имеющимися антителами. Вторая возможная причина заключается в том, что молекулы сахаров. Входящие в состав гликопротеина оболочки HIV, сходны с аналогичными структурами на поверхности клеток человека, поэтому на оболочке вируса недостаточно уникальных участков, которые будут распознаваться иммунной системой как “чужие” и с которыми могли бы связываться антитела. В-третьих, в молекулах gp120 участок связывания CD4 расположен в углублении и потому мало доступен. Наконец, не исключено, что важные для связывания участки gp120 открыты только в момент связывания, а большую часть времени недоступны для иммунной системы.
Чтобы преодолеть эти трудности применяется несколько подходов. Один состоит в получении моноклональных антител. Для этого нужно идентифицировать антитела, которые действительно связываются с ключевым участком вирусного белка, клонировать производящие их лимфоциты и выращивать эти клетки in vitro.
Второй подход использует антиидиотипические антитела, т.е. “антитела против идиотипа”; в данном случае это антитела против антител к CD4. Идея заключается в том, что молекула моноклонального тела против CD4 по структуре может имитировать участок связывания CD4 в молекуле gp120, и поэтому антитело (антиидиотип) к этому участку должно связываться с gp120.
Третий подход заключается в создании растворимой, т.е. не связанной с клетками формы CD4, которая способна взаимодействовать с HIV, занимая его участки связывания и тем самым препятствуя его связыванию с CD4 на поверхности Т4-хелперов. В настоящее время растворимый CD4 был получен методами генной инженерии. Этот препарат действительно блокирует участки связывания CD4 на оболочке HIV и подавляет заражение Т-клеток. Вероятно, вирусу трудно будет измениться таким образом, чтобы потерять сродство к CD4, сохраняя при этом способность заражать другие клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
