Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

G = 2,3 RT lg(K_R/K_T) кДж/моль. (7)

Для гемоглобина человека при 37°С эта "свободная энергия кооперативности" равна 5,61 кДж/моль. В физиологических условиях при отсутствии кислорода лишь ~ 310⁵ % молекул гемоглобина находятся в R-форме, а в условиях полного насыщения кислородом лишь ~ 7-10³ % — в Т-форме. [2]

Изменения электронной и пространственной структуры гемоглобина в процессе оксигенации На рис.4 схематически показаны электронная структура железа гема, положение атома железа относительно плоскости порфиринового кольца гема, спектральные и магнитные характеристики молекул в различных состояниях молекулы гемоглобина: дезоксигемоглобин, оксигемоглобин и ферригемоглобин. Следует подчеркнуть, что во всех случаях речь идет о равновесных состояниях молекул белка. Мы увидим далее, что переход из одного состояния в другое требует значительного (в молекулярных масштабах) времени, в течение которого система проходит через несколько неравновесных состояний, заметно отличающихся по своим физическим и химическим свойствам от равновесных. [2]

В молекуле дезоксигемоглобина железо отстоит от плоскости порфиринового кольца примерно на 0,5-0,6 А° (есть небольшие отличия между - и -субъединицами). Из шести 3d электронов железа Fe(II) два электрона спарены на одной из низших d-орбиталей (d_xy, d_yz, d_xs), а четыре электрона занимают оставшиеся d-орбитали, их спиновые моменты, согласно правилу Хунда, параллельны и суммарный спин S-2. Магнитный момент гема в этом состоянии равен ~ 5,5 боровского магнетона (БМ), а спектр поглощения в зеленой области имеет характерную полосу с _max ~ 556 нм. Присоединение кислорода ведет к значительным изменениям. Атом железа в оксигемоглобине лежит практически в плоскости порфиринового кольца (расстояние до плоскости составляет 0,16 А° в α- и 0,00 А° в β- субъединицах). Все шесть d-электронов спарены на трех низших d-орбиталях, S= 0, оксигемоглобин диамагнитен. В зеленой области спектра имеются две характерные полосы поглощения: а (_max 576 А°) и b (542 А°).

Рис.4. Основные характеристики молекулы гемоглобина в различных состояниях.

В ферригемоглобине (метгемоглобин) при нейтральных значениях рН место кислорода занимает молекула воды (при щелочных значениях рНОН), железо находится значительно ближе к плоскости гема, чем в дезоксигемоглобине, все пять d-электронов неспарены и занимают пять d-орбиталей. S = 5/2 и магнитный момент равен 5,91 БМ.

Структурные изменения в активном центре (вблизи гема) приводят и к значительным изменениям пространственной структуры всего белка. При оксигенации (переход от Т- к R-форме) смещение отдельных аминокислотных остатков достигает 7 А. Как уже было сказано выше, четвертичная структура гемоглобина характеризуется наличием четырех полипептидных цепей, образующих две (- и две -субъединицы). Более детальные исследования показали, что субъединицы образуют -димеры. ТR – переход сопровождается поворотом одного димера относительно другого на 12-15 и в конечном счете приводит к увеличению карманов, в которых находятся гемы. Эти структурные изменения инициируются присоединением первой молекулы О₂ к одному из свободных гемов и распространяются на всю глобулу. Именно поэтому в равновесной смеси всегда присутствуют только Т- и R-формы. Эти димеры в Т-форме стягиваются 14 дополнительными (по сравнению с R-формой) солевыми мостиками (водородные связи между ионными или нейтральными группами аминоксилот, ван-дер-ваальсовы контакты). Кроме того, между -субъединицами в Т-форме присоединяется молекула дифосфоглицерата, что также приводит к сужению карманов. Эти изменения схематически представлены на рис.5.

Триггером для всех описанных выше структурных перестроек при переходах между Т- и R-формами и обратно служит присоединение или отщепление кислорода. После локального элементарного химического акта: присоединение или отщепление низкомолекулярного лиганда, окисление железа при образовании ферригемоглобина (иначе говоря, после появлении лишнего положительного заряда на железе) – возникает существенно неравновесное конформационное состояние – изменения вблизи активного центра уже произошли, а вся огромная молекула белка осталась в прежнем, еще не отрелаксировавшем состоянии. Последующая релаксация может занимать микросекунды и даже секунды. В ходе этой релаксации меняются не только физические, но и химические свойства белка, в частности скорости последующих химических актов, если они успевают произойти до полного завершения релаксации. Таким образом, описанная выше картина процессов, сопровождающих обратимое связывание кислорода гемоглобином, является лишь первым, хотя и очень важным приближением к истине. Так, например, быстрое восстановление железа в ферригемоглобине коротким (микро- или наносекунды) импульсом электронов приводит к возникновению неравновесного состояния, в котором железо уже восстановлено, но не отошло от плоскости порфиринового кольца. По спектральным и магнитным характеристикам это состояние соответствует равновесному оксигемоглобину. Релаксация гема и его ближайшего окружения с удалением железа от плоскости порфиринового кольца занимает при комнатной температуре десятки микросекунд, а полная релаксация всей белковой глобулы к равновесной Т-форме дезоксигемоглобина — сотни миллисекунд.

Рис. 5. Структурная схема перехода гемоглобина от Т- к R-форме

Другие реакции и функции гемоглобина При взаимодействии молекулярного кислорода с гемоглобином существует небольшая, но конечная вероятность окисления последнего: молекула О₂ не присоединится, но окислит железо: Fe²⁺ + O₂ Fe³⁺ O₂. Поэтому при дыхании в эритроцитах непрерывно образуется метгемоглобин. Для его восстановления в эритроците существует специальная ферментативная система, восстанавливающая метгемоглобин и превращающая его в нормальный дезоксигемоглобин. При нарушении этой системы возникает тяжелое заболевание — метгемоглобинемия, при котором гемоглобин перестает быть переносчиком кислорода.

Гены, ответственные за синтез гемоглобина, могут подвергаться мутациям, меняющим структуру и функции белка. Наиболее изучена мутация, приводящая к замене только одной аминокислоты в полпептидных цепочках -субъединиц гемоглобина. Замена глутамина на валин ведет к тяжелой болезни – серповидноклеточной анемии: эритроциты принимают форму серпа и теряют способность переносить кислород.

Присоединение кислорода меняет кислотно-основные свойства гемоглобина. Оксигемоглобин является более сильной кислотой, чем дезоксигемоглобин. Поэтому в тканях, где значительная часть гемоглобина теряет кислород и становится более сильным основанием, гемоглобин связывает образующуюся в ходе метаболических внутриклеточных процессов углекислоту. В альвеолах легких дезоксигемоглобин снова превращается в оксигемоглобин, становится более сильной кислотой и способствует отщеплению СО₂. Это слегка упрощенное описание важного процесса транспорта углекислоты эритроцитами. Углекислота, освобождаемая тканями, недостаточно хорошо растворима для эффективного переноса. С помощью фермента карбоангидразы, ускоряющего прямую и обратную реакцию

СО₂+Н₂ОНСО₃+Н⁺ (8)

двуокись углерода превращается в хорошо растворимый бикарбонат-анион. В капиллярах тканей отщепление кислорода повышает содержание дезоксигемоглобина, связывающего протоны и смещающего, таким образом, равновесие реакции (8) вправо. Легко растворимый ион бикарбоната переносится кровью. В альвеолах легких гемоглобин оксигенируется, протоны освобождаются и равновесие (8) смещается влево. Образуется плохо растворимая двуокись углерода СО₂, которая удаляется из водной фазы и выдыхается. Таким образом, гемоглобин работает как буфер с переменным значением pK. Функция гемоглобина как переносчика углекислоты не менее важна, чем его функция переносчика кислорода.

Гемоглобин – одно из наиболее хорошо изученных белков. Десятки лет исследований гемоглобина в описании и понимании физических, химических и биологических аспектов его функционирования. Огромный вклад внесли работы Макса Перутца и его сотрудников в Кавендишской лаборатории (Кембридж, Великобритания). Однако важность этих работ касается не только гемоглобина. Они послужили основой развития современных представлений о механизмах ферментативного катализа, связав непосредственно кинетику и термодинамику биохимических реакций с динамикой конформационных изменений макромолекул белка. Если отвлечься от непосредственной практической пользы полученных результатов для медицины, фармакологии, то фундаментальное значение работ по изучению механизма функционирования гемоглобина заключается в стимулировании прогресса в установлении законов протекания важнейших процессов: ферментативного катализа и внутриклеточной трансформации энергии в биологических системах. [2]

Об участии гемоглобина в мембранной организации эритроцитов свидетельствует феномен образования серповидной и других форм эритроцитов при различных гемоглобинопатиях, первооснову которого и составляет аномальное взаимодействие эритроцитарной мембраны с мутантными гемоглобинами. Не исключено, что изменение упруго-механических свойств эритроцитарных мемран при повышении отрицательного заряда их внешней поверхности происходит вследствие улучшения условий для создания и структурирования белкового слоя, формируемого с участием гемоглобина на внутренней поверхности эритроцитарных мембран. [13]

Показано, что при получении безгемоглобиновых теней эритроцитов в препаратах электронно-микроскопически обнаруживается большое количество везикул диаметром примерно 100 нм, что свидетельствует о частичной фрагментации плазматической мембраны эритроцитов. В то же время если в мембранах содержится много гемоглобина и других белков, обнаруживаемых в примембранных слоях, то фрагментации мембраны определяемой таким образом, не наблюдается. Имеются и другие доказательства стабилизирующего действия гемоглобина на эритроцитарные мембраны. Например, S.Knutton и соавторам удалось получить две фракции эритроцитарных мембран, различающихся содержанием связанного с ними гемоглобина. Ими было показано, что во фракции эритроцитарных мембран с большим содержанием гемоглобина разрушение липопротеиновой структуры мембран при их дегидротации происходит намного слабее, чем в случае с фракцией эритроцитарных мембран с малым содержанием гемоглобина. В основе изменения условий для структурирования белково-образующего примембранного слоя внутри эритроцитов может лежать изменение электрических поверхностных свойств на внешней стороне. Это возможно вследствие того, что для мембран в липидной зоне дебаевский радиус экранировки зарядов гораздо больше ее толщины, в результате поверхностные заряды с обеих сторон эритроцитарных мембран взаимно влияют друг на друга, образуя самосогласованную систему. Кроме того, условия для образования белкового слоя, стабилизирующего мембраны эритроцитов, могут изменяться и в результате защелачивания их внутренней среды, что имеет место при суспендировании эритроцитов в щелочной или неэлектролитной среде, например, сахарозной. Это может способствовать гемоглобину и другим примембранным белкам за счет изменения их свойств образовывать прочный примембранный белковый слой (в отношении гемоглобина, например, известно, что его свойства, в том числе кислородосвязывающие, сильно изменяются при варьировании рН). Вместе с тем защелачивание внутренней среды эритроцитов не всегда может служить фактором, стабилизирующим их структуру. В литературе, например, утверждают, что для эритроцитов новорожденного теленка, для которых характерно наличие фетального гемоглобина, любые экспериментальные манипуляции, результатом которых является внутриклеточное защелачивание среды, вызывают их самопроизвольный гемолиз. По мере развития организма теленка (2-3 месяца жизни) эритроциты с нормальным гемоглобином, появляющиеся взамен вытесняемых из кровеносного русла клеток, содержащих фетальный гемоглобин, становятся устойчивыми к внутриклеточному защелачиванию их среды. При этом важно отметить, что, по данным литературы, в гемолизе фетальных эритроцитов при защелачивании их внутренней среды, помимо фетального гемоглобина, определенная роль принадлежит и мембранному белку band III. [13]

Приведенные литературные данные дают основание сделать вывод о тесной взаимосвязи процессов метаболизма, трансмембранного транспорта, изменений формы и механических свойств эритроцита, что, по-видимому, позволяет организму осуществлять координированную регуляцию функционирования клетки через соответствующие рецепторные структуры, имеющиеся на наружной поверхности мембраны. [9]

Таким образом, в поддержании структурной целостности эритроцитов важное значение имеют внутренние примембранные белковые слои, структура и взаимодействие которых с эритроцитарными мембранами взаимно обусловлены и в целом представляют собой единую структурную организацию. Поэтому всякая модификация как самой мембраны, так и содержащегося в них гемоглобина в конечном счете сопровождается и модификацией этой особой организации, частным примером проявления которой может быть изменение ее механических свойств. [13] Приведенные данные побудили нас провести исследование с целью оценки количественного содержания мембрансвязанного гемоглобина эритроцитов человека и его связи со структурными белками.

материал и методы исследования

Материал исследования

Материалом настоящего исследования послужили эритроциты 124 практически здоровых лиц, проживающих в городе Курске, в возрасте от 18 до 47 лет. Набор добровольцев проводился при исключении любой соматопатологии.

У обследуемых проводился забор крови из локтевой вены в сухую стерильную посуду в количестве 5-7 мл с целью получения образов эритроцитарных мембран.

Методы исследования

Для достижения поставленной цели и решения задач настоящей работы использовался комплекс методов.

Биохимические методы.

Реактивы и биоматериалы. В работе использовались: декстран Т-500 фирмы "SIGMA" (США), HBS – целлюлоза фирмы "SIGMA" (США), гидрофосфат натрия, хлористый натрий, мочевина фирмы "Bio-Rad" (США), трис, 2 – меркаптоэтанол, персульфат аммония "Reanal" (Венгрия), додецилсульфат натрия (ДДС) фирмы "Диа-Фарм" (Россия), акриламид "SIGMA" (США), N,N - метилен бисакриламид "FLUKA" (Швейцария), кумасси G – 250 фирмы "Serva" (ФРГ), бромфеноловый синий, ТЕМЕД, глицин, набор белков для определения молекулярного веса MS-2 (Россия).

Реактивы отечественного производства были марки "ХЧ" и "ОСЧ".

Получение эритроцитов. Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной крови по методу Бейтлера с незначительной модификацией. [14] Сначала гепаринизированную кровь отстаивали дважды в растворе PBS, содержащем 3% декстран Т –500, в течение 30 минут. Затем эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке, пропуская ее через колонку с HBS-целлюлозой, после чего эритроциты ценрифугировали при 3000 оборотах в минуту. Далее из полученной очищенной массы эритроцитов проводили выделение мембран.

Характеристики

Список файлов реферата