Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Затем идет реакция стабилизации, которая приводит к разделению края клетки на активные и неактивные участки. Разделение приводит к вытягиванию клетки в переднезаднем направлении и делает её асимметричной. Следовательно, движение клетки становится возможным лишь после возникновения асимметрии. Но до сих пор неясна роль бегущей волны сокращения от переднего края к телу клетки и общего сокращения кортикального матрекса в хвосте клетки. Некоторые авторы считают, что сокращения в области хвоста участвуют в продавливании цитоплазмы из тела клетки в ламеллоподию (Coates T.P. et. al 1992).

На заднем конце движущейся клетки есть хвост и ретракционные волокна. Хвост представляет скопление на конце клетки концов ретракционных волокон. Хвост нейтрофила адгезивен к субстрату и в нем наблюдаются сокращения. Образовавшаяся ламеллоподия вступая в контакт с субстратом создает натяжение в хвосте клетки, вызывая этим его отрыв от субстрата и перемещение клетки вперед. Когда перемещение клетки осуществилось, ламеллоподия исчезает и наступает кратковременное «покоящееся состояние». Затем снова начинают образовываться новые ламеллоподии и ретракционные волокна, и всё повторяется сначала (Нерсесова 1977).

Цитоплазма у нейтрофилов находится в постоянном движении. Когда клетка пребывает в состоянии покоя, то токи цитоплазмы беспорядочны, а когда клетка движется, они направлены внутрь ламеллоподии на ведущем крае.

Нейтрофил способен производить сокращения. Это предполагает наличие сократительных структур. Актин и миозин - белки, которые находятся в мышечных клетках. В нейтрофилах, которые не имеют мышечных структур, тем не менее, есть белки сходные с актином и миозином. Актиноподобный белок очень похож на мышечный актин по молекулярному весу, структурной организации, способности активировать миозиновую АТФазу, связываться с миозином. У клеток, которые имеют не мышечную подвижность, актин вместе с миозином составляет сократительную систему, но при этом актин выступает как структурный белок. В не мышечных клетках 50% актина находится в неполимеризованной форме (G – актин), а в мышечных клетках актин на 100% полимеризован (F – актин). Такое содержание актина G и F в не мышечных клетках обусловлено взаимодействием актина с актин – связывающими белками. Известно более 100 актин связывающих белков. Альфа – актинин сшивает филаменты F – актинового геля. Другой важный белок это гельзолин. Он принимает участие в локомоции (движение обеспечивающее активное перемещение в пространстве) и транспорте везикул (пузырьков) через кортекс.

Миозиноподобные белки составляют очень малый процент (от 0.2-0.8% от общего содержания белков клетки). Молярное отношение актина к миозину в полиморфно-ядерных лейкоцитах составляет 100:1. (Crawford N., Chahal., Jackson P. 1980) Миозиноподобные белки являются ферментами, они обладают АТФазной активностью и способностью соединяться с актином. (Красовская И.Е. 1977; Omann G. M. et al 1987).

Предполагается, что в области псевдоподий актин деполимеризован. Асимметрия F – актина возникает ещё в неполяризованных клетках при активации их хемоаттрактантами и предшествует возникновению клеточной асимметрии. Снижение содержания F – актина уменьшает жесткость актинового каркаса клетки и каркас продавливается в области где произошла деполимеризация актина. Начальная реакция полимеризации актина не зависит от концентрации Ca⁺⁺ в нейтрофилах, а реакция деполимеризации актина зависит от внутриклеточного Са⁺⁺. Вторая фаза полимеризации актина зависит от концентрации внутриклеточного Са⁺⁺ и возможно связана с функциями нейтрофила, такими как респираторный взрыв и дегрануляция. Одновременно с полимеризацией актина при действии хемоаттрактантов происходит фосфорилирование миозина. Фосфорилирование миозина и обнаружение миозина в области псевдоподии указывает на участие сократительного аппарата в образовании псевдоподии. (Omann G.M. et. al 1987)

Методы исследования подвижности нейтрофилов

Впервые скорость движения отдельных нейтрофилов измерил McCutcheon в 1923 году.

В 1962 году Boyden разработал метод количественной оценки подвижности популяции нейтрофилов. Метод заключается в миграции лейкоцитов через тонкий фильтр, который разделял камеру на два отсека. В верхний отсек помещали суспензию клеток, клетки оседают на фильтр и переходят через поры в нижний отсек. Размер пор для нейтрофилов 3 мкм, для эозинофилов 5 мкм, для макрофагов 8 мкм. Чтобы оценить хемотаксис нейтрофилов, нужно нижний отсек заполнить раствором содержащий хемоаттрактант. Этот метод эффективен в оценке хемотаксиса, но не случайного блуждания т.к. движение лейкоцитов не является свободным. Недостаток этого метода в том, что он не позволяет наблюдать клетки в процессе движения, а оценка двигательной активности по самым подвижным клеткам популяции.

В 1975 году был изобретен новый метод исследования подвижности под агарозой. Чашки Петри заполняются горячим раствором агарозы в физиологическом растворе. При застывании раствора образуется гель, в котором проделывают лунки до дна чашки, а в лунки помещают суспензию клеток. Клетки начинают двигаться через лунки на дно чашки Петри под гель, по радиусу разбегания оценивается свободное блуждание. Если надо исследовать хемотаксис, то рядом с первой лункой делают ещё одну, в которую помещают раствор хемоаттрактанта. Агарозный гель полупрозрачен и можно наблюдать через микроскоп за живыми клетками. Недостаток метода является длительное время инкубации для получения картины разбегания клеток из лунки.

При использовании методов, описанных выше, необходимо проводить дополнительные исследования для различения случайного блуждания, хемотаксиса или хемокинеза. Такие методы исследования не дают возможности изучать отдельные клетки во время движения.

В 1953 году Харрис впервые использовал автоматический метод съемки движущихся нейтрофилов. Этот метод был использован в клинических исследованиях.

Полностью автоматизированные методы появились, когда были решены проблемы оптического выделения объектов и были созданы программы слежения за движущимися клетками (Туманов и соавт. 1990). В исследовании подвижности нейтрофилов важен выбор межкадрового интервала. В экспериментах (Hartoman R. S. el al 1994), средняя скорость движения при интервалах регистрации 4 сек. была 17 мкм/мин., а при интервалах 36 сек, составляла 9.9 мкм/мин. Отличие связано с тем, что размер нейтрофила составляет 10 мкм, а время нужное на перемещение равное клеточному диаметру приблизительно равно 1-1.5 минут. Поэтому для оценки внешнего движения используют 1 минутный межкадровый интервал, нейтрофилы за этот интервал времени перемещаются в среднем на величину клеточного диаметра. Такая регистрация позволяет оценить воздействие химических и физических факторов на подвижность нейтрофилов, проводить сравнение в норме и патологии.

Регистрация внутреннего движения используется для более подробного исследования изменений подвижности. Для этого выбирается межкадровый интервал такой, чтобы при непрерывном измерении перемещение центра массы клетки, связанное с изменением формы клетки за время межкадрового интервала не превышало клеточного диаметра (Hartman R. S. Lau K. Chou. W. Coates T. D. 1994).

Анализ траекторий случайного блуждания клеток, которые регистрируют с интервалом 2 сек. показывает, что поведение клеток отличается на малых и больших временах наблюдения. По степени корреляции разделяют два вида траектории движения:

1. Персистентное движение – клетка некоторое время пытается сохранить величину и направление движения.

2. Диффузионное движение – связано с внутренними процессами в клетке стремящимися изменить направление движения клетки.

Среднее время перехода между этими двумя формами движения называется характерным временем или временем персистентного движения (Tranquillo R.T. at al 1988).

Движение нейтрофилов изучали на покровных стеклах. Движение клеток происходит по определенной траектории, у каждой клетки она своя. Форма траекторий разнообразна, от плотного клубка до расплетенных нитей. Нейтрофилы бывают: медленные, средние и быстрые. Медленные – это клетки, которые вытягивают ламеллоподии в разные стороны, но в результате отсутствия скоординированного двигательного акта они стоят на месте или движутся но очень медленно. Средние клетки имеют траекторию более запутанную в виде плотного клубка из-за того, что они больше стоят на месте и углы поворотов у них больше. Быстрые клетки имеют меньшие углы поворотов и меньше времени стоят на месте, следовательно, их траектория более прямая. Такой вывод был сделан по произвольно выбранным клеткам. Время пребывания в фазе активности и углы поворотов определяются внутренней программой клетки.

Подвижность нейтрофилов может служить показателем тяжести состояния больных с раневой инфекцией.

Табл. 1 Средняя скорость движения и процентный состав нейтрофилов в группах здоровых доноров и больных с раневой инфекцией.

У тяжелых больных средние скорости нейтрофилов распределены в диапазоне от 0 до 6 мкм/мин. Такой широкий диапазон средних скоростей из-за того, что больные подвергаются интенсивному лечению (операции, антибиотикотерапия). У больных средней тяжести, скорости распределены в области от 4.5-9 мкм/мин. Ухудшение состояния больного происходит из-за уменьшения клеток в популяции. При тяжелом состоянии средняя скорость в популяции ниже 3 мкм/мин, а скорость 5-6 мкм/сек говорит о том, что состояние средней тяжести.

Нарушение подвижности нейтрофилов было обнаружено у ожоговых больных и больных с острой пищевой токсикоинфекцией. В каждой группе было исследовано по 5 больных. В группу ожоговых больных входили тяжелые больные с площадью ожогов 50% поверхности тела. Группу с острой пищевой токсикоинфекцией составляли больные с тяжелой сальмонеллезной эндотоксимией. У этих больных интоксикация приводит к сильному угнетению подвижности нейтрофилов.

Табл. 2 Скорость движения и процентный состав неподвижных, медленных и быстрых нейтрофилов у ожоговых больных и больных с острой пищевой токсикоинфекцией.

Бактерии способны выделять хемоаттрактанты, которые притягивают нейтрофилы в зону инвазии (способность возбудителей проникать и распространяться в организме). Бактериальные хемоаттрактанты типа формил – пептида при больших концентрациях проявляют эффект «западни» угнетая движение нейтрофилов.

Алгоритм работы модели клетки

В поле зрения микроскопа клетка движется по случайной траектории. Из начального положения клетка может перемещаться на случайное расстояние в отрезке от 0 до r_max, под случайным углом от 0 до 180⁰.

Случайный шаг характеризуется распределением:

рис. 3 Распределение (частота встречаемости) шагов, на которые клетка перемещается за выбранный промежуток времени (1 минута).

Клетка во время движения может менять как шаги, так и углы поворотов, от 0 до 180⁰. Углы меняются по отношению к предыдущему направлению клетки.

Случайные углы поворота нейтрофилов характеризуются распределением:

рис. 4 Распределение углов поворотов при случайном движении. Углы распределены от 0 до 1800, знак угла считается равновероятным.

Из распределения углов поворота видно, что нулевой угол встречается чаще, следовательно, он наиболее вероятен, а угол 180⁰ наименее вероятен. Из этого следует, что клетка при движении сохраняет свое направление. Углы поворотов распределены от 0 до 180⁰, при этом знак угла считается равновероятным (вправо или влево). В соответствии с такой гипотезой строится алгоритм модели движения клетки.

Нейтрофилы разделены на три типа: быстрые, средние и медленные. Три типа клеток различаются между собой по максимально возможному шагу в единичном акте движения. Для медленных клеток эта величина составляет 3 мкм (величина меньше размера клетки). Для средних клеток – 10 мкм (величина, немного превышающая размер клетки). Для быстрых клеток составляет 30 мкм.

Вычисление координат клетки

Координаты каждой последующей клетки вычисляются из предыдущего. Программа генерирует три случайных числа в соответствии с заданными распределениями (для каждого вида нейтрофилов своё распределение)

Характеристики

Список файлов реферата