11398 (647027), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Дальне шее изучение основного белка холодового шока Listeria monocytogenes при помощи двумерного электрофореза показало, что его изоэлектрическая точка составляет 5.1. При помощи N-терминального сиквенса полученного при помощи двумерного электрофореза белка была установлена его полная идентичность с негеминовым железосвязывающим ферритином из Listeria innocua. Очистка этого ферритин-подобного белка позволила установить, что его нативная молекулярная масса составляет около 100–110 кДа, что свидетельствует о том, что он состоит из шести 18 кДа субъединиц. Нозерн-блот анализ показал присутствие его 0.8 kb мРНК в клетках во время фазы экспоненциального роста, а также значительное увеличение количества мРНК этого белка как после падения, так и после возрастания температуры.

CSPA является основным белком холодового шока E. coli, его синтез значительно возрастает в ответ на холодовой шок. Аминокислотная последовательность CSPA имеет 43% идентичности «домену холодового шока» эукариотического Y-box семе ства белков, члены которого взаимодействуют с РНК и ДНК для регуляции их функций. Показано, что CSPA кооперативно связывается с денатурировавшими под действием низко температуры одноцепочечными РНК, размером больше, чем 74 основания. Для его кооперативного связывания необходима минимальная концентрация CSPA 2.7х10^-5 М, что значительно ниже, чем присутствующая в клетке после холодового шока концентрация CSPA. Для связывания CSPA не было установлено специфических последовательностей РНК, что показывает, что он может связываться с широким спектром последовательностей. Когда состоящий из 142 оснований 5'-нетранслируемый участок собственной мРНК CSPA был использован как субстрат для рибонуклеаз А и Т1, добавление CSPA значительно стимулировало гидролиз РНК путем предотвращения образования РНКазоустойчивых связей из-за образования стабильных вторичных структур в 5'-нетранслируемом участке. Эти данные показывают, что связывание CSPA с РНК дестабилизирует вторичную структуру РНК и делает ее доступно для рибонуклеаз. Предполагается, что CSPA действует как шаперон РНК для предотвращения образования вторично структуры у РНК при низких температурах. Эта функция CSPA может быть необходима для эффективно трансляции мРНК при низких температурах и, по-видимому, может также оказывать влияние на процесс транскрипции.

При падении температуры в клетках Escherichia coli обнаружена сильная индукция синтеза важнейшего белка холодового шока – CSPA. Поскольку этот белок весьма консервативен, был использован подход, основанный на PCR с использованием пары дегенерированных праймеров, полученных из высоко консервативных областей cspA-связанных белков, чтобы доказать присутствие как минимум трех связанных с cspA генов в Lactacoccus lactis. Один из них, cspB, был клонирован и секвенирован. Он кодирует белок из 66 аминокислот, который обладает 60% тождественности последовательности с CSPA из Escherichia coli. После холодового шока уровень транскриптов мРНК CspB увеличивался, что было показано при помощи нозерн-блот гибридизации. Кроме того, наблюдалась индукция активности CSPB-зависимой бета-галактозидазы. Эти результаты указывают на то, что ген cspB из L. Lactis индуцируется холодовым шоком.

Белок холодового шока Bacillus subtilis, CSPB, после гипотермии влияет на уровень содержания нескольких других белков холодового шока в B. Subtilis. Экспрессия CSPB в Escherichia coli при 37⁰C – в условиях, когда белки холодового шока CSPA и CSPB E. Coli не обнаруживаются – приводит к заметному снижению скорости роста клеток и имеет значительное влияние на уровень синтеза других белков. При этом происходит как уменьшение, так и увеличение уровне синтеза специфических белков. В частности, индукция CSPB приводит к усилению активности бета-галактозидазы, экспрессированной из слитых транскриптов hns-lacz. Это увеличение отражает индукцию транскрипции hns и синтеза HNS после холодового шока и in vitro зависит от присутствия CSPA. Напротив, экспрессия мутантной формы CSPB, которая неспособна связываться с суперскрученной ДНК in vitro, не имела влияния на степени увеличения экспрессии генов, уровня синтеза белка или активность бета-галактозидазы. Эти данные демонстрируют сильное влияние CSPB на синтез белка в E. Coli и предполагают аналогичную функцию для CSPA в E. Coli по сравнению с CSPB в B. Subtilis. Однако впоследствии было установлено, что CSPA и CSPB по-разному связываются с одноцепочечной ДНК. В частности, в ходе этих исследований было установлено, что, если CSPB связывает поли-Т олигонуклеотиды примерно на порядок сильнее, чем поли-U или поли-С одноцепочечные ssДНК, тогда как CSPA связывает поли-Т, поли-U и поли-С ssДНК с одинаковой интенсивностью.

Как и другие бактерии, Bacillus subtilis обладает семейством гомологов небольших кислых белков, синтез которых индуцируется в ответ на холодовой шок. Делеция генов cspC или cspD не приводит к видимому изменению фенотипа; напротив, двойные мутанты по генам csp проявили серьезное снижение скорости клеточного роста как при 15⁰C, так и при 37⁰C и ухудшение выживаемости во время стационарно фазы роста. С помощью двумерного гель-электрофореза показано, что у двойных мутантов по генам csp разрегулирован синтез белка и потеря одного или двух белков CSP приводит к увеличению синтеза остаточных CSP при 37⁰ C и после холодового шока, что позволяет предположить, что CSP ингибируют синтез других членов этого семе ства белков. Тройной мутант cspB/C/D мог размножаться только в присутствии CSPB, перенесенного плазмидой, что свидетельствует о том, что хотя бы минимальное количество гена csp необходимо для жизнеспособности B. Subtilis. После холодового шока синтез CSPB в 64bcdbt был намного ниже, чем в клетках дикого типа, что сопровождалось прекращением роста и значительным уменьшением общего синтеза белка. Поскольку как CSPB, CSPC, так и CSPD показали способность связывать РНК кооперативным и интерактивным способом, предполагается, что белки CSP действуют как РНК-шапероны, облегчающие инициирование трансляции при оптимальных и низких температурах.

При изучении характеристик CSPB было установлено, что CspB из Bacillus subtilis конформационно стабилен лишь в двух граничных состояниях, но чрезвыча но быстро меняет свою укладку между этими стабильными состояниями. Изучение соответствующих белков холодового шока из термофильно Bacillus caldolyticus и гипертермофильно Thermotoga maritima показало, что они обладают значительно более высоко конформационной стабильностью, но с неизменно очень быстро кинетико переходов между двумя стабильными состояниями. По-видимому, это неотъемлемое свойство небольших белков, полностью состоящих из изгибов.

В белке холодового шока CSPB из Bacillus subtilis имеются три незащищенных остатка фенилаланина, которые необходимы для его функционирования при связывании с одноцепочечными суперскрученными нуклеиновыми кислотами. Обычно гидрофобные боковые цепи фенилаланина в складчатых белках спрятаны. Авторами была предпринята попытка выяснить, может ли экспозиция этих остатков фенилаланина быть причиной низкой конформационной стабильности CSPB. В ходе экспериментов были измерены индуцированные мочевиной и индуцированные нагревом равновесные переходы для трех мутантов CspB, у которых Phe 15, Phe 17 и Phe 27 индивидуально были заменены аланином. Неожиданно было обнаружено, что все три мутации сильно дестабилизировали CspB. Таким образом, ароматические боковые цепи Phe 15, Phe 17 и Phe 27 в активном сайте важны и для связывания с нуклеиновыми кислотами, и для конформационной стабильности.

В целом, согласно современным представлениям, бактериальные белки холодового шока функционируют как регуляторы трансляции и РНК-шапероны. Во время роста при 37⁰С CSP связываются с мРНК и поддерживают ее в лине но форме. Во время трансляции рибосомы вытесняют CSP с мРНК, поскольку CSP обладают более низким сродством к мРНК. Во время холодового шока происходит резкое увеличение содержания CSP, поскольку это необходимо для уравновешивания возрастания стабильности вторично структуры мРНК.

Искусственное снижение концентрации CSP приводит к образованию вторично структуры мРНК и прекращению процесса трансляции.

После резкого падения температуры различные виды бактерий проявляют мультигенный ответ. Доказательства такого рода ответа на действие холода у Salmonella typhimurium были получены при определении диапазона индуцируемых низкими температурами слияний генов, содержавших Mudlux-вставки. Из выделенных Mudlux-слияний генов было найдено одно, которое не производило детектируемого свечения во время выращивания при 30⁰C, но проявило быстры и высоки уровень индукции при снижении температуры до 10⁰C. Мишень данного слияния гена, как было показано, расположена по соседству с umudc опероном и кодирует гомолог основного белка холодового шока Escherichia coli, CSPA. Изучение люминесценции показало, что детектируемое свечение происходило от слияния CspB: Mudlux при температурах ниже 22⁰C, но не при более высоких температурах, даже после падения температуры от 30⁰C. Более того, было обнаружено, что уровни содержания мРНК CSPB соответствуют данной модели люминесценции, что позволяет предлагать, что экспрессия cspB происходит ниже определенно пороговой температуры. Как было обнаружено, мРНК CSPB очень стабильна при 10⁰C, но становится чрезвычайно нестабильно, когда температура поднимается выше порогово. Существующие клеточные РНКазы, таким образом, по-видимому, опосредуют разрушение мРНК CSPB при высоких температурах, но не способны совершать это при низких температурах.

Необходимо отметить, что белки холодового шока у мезофильных и термофильных бактерий имеют большое сходство в структуре, но весьма отличаются в стабильности. Сравнение структуры CSP из мезофилов и гипертермофильно бактерии Thermotoga maritima показало большую значимость определенных заряженных групп белковой молекулы для ее стабилизации при низкой температуре.

Характеристики

Список файлов реферата