10020 (646268), страница 6

Файл №646268 10020 (Мембранная энзимология) 6 страница10020 (646268) страница 62016-07-31СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 6)

2) истощение микросомной мембраны по фосфатидилхолину;

3) дефосфорилирование самого фермента, в результате чего он переходит в мембраносвязанную активную конформацию. Для установления истинного механизма необходимы дальнейшие исследования.

Показано, что в зависимости от содержания мембраносвязанных диацилглицеролов фермент диацилглицеролкиназа может перемещаться из цитозоля в мембрану. Он катализирует превращение диацилглицерола в фосфатидную кислоту и по крайней мере частично ответствен за утилизацию диацилглицерола в мембране. Диацилглицерол и жирные кислоты участвуют также в связывании а-актинина с мембранами. Полагают, что определенную роль в прикреплении пучков микрофиламентов к плазматической мембране играет и диацилглицеролкиназа. Возможно, индуцируемое диацилглицеролом и жирными кислотами образование комплексов а-актинина и актина является важным элементом физиологической активности тромбоцитов.

Остановимся вкратце еще на двух ферментах, которые в определенных условиях связываются с биомембранами: пируватоксидазе и фосфатидилсеринсинтетазе из Е. coli. В присутствии субстрата оба фермента перемещаются из цитозоля в цитоплазматическую мембрану. Пируватоксидаза уже упоминалась как пример липидзависимого фермента. В присутствии пирувата, восстанавливающего связанный с белком флавиновый кофактор, фермент по своим свойствам становится классическим мембранным белком. Он восстанавливает растворенный в мембране убихинон и поэтому для своего функционирования должен быть связан с мембраной. В норме при очистке фосфатидилсеринсинтазы она выделяется в связанном с рибосомами виде, но в присутствии либо субстрата, либо продукта оказывается связанной с мембраной.

6.4 Растворимые ферменты или ферментные ансамбли, которые in vivo могут быть ассоциированы с мембраной

В литературе все чаще появляются данные о возможной ассоциации целого ряда растворимых ферментов с мембраной. Большинство работ посвящено связыванию ферментов цикла трикарбоновых кислот и /3-окисления жирных кислот с внутренней митохондриальной мембраной и ферментов гликолиза с плазматической мембраной эритроцитов. Приводятся доказательства, хотя и не вполне убедительные, что ферменты митохондриального матрикса организованы в связанные с поверхностью мембраны мультиферментные комплексы. В некоторых случаях удалось выявить специфические центры связывания. Например, NAD + - зависимые дегидрогеназы образуют комплексы с NADH: убихинон оксидоредуктазой. Креатинфосфокиназа специфически связывается с кардиолипином во внутренней митохондриальной мембране; гексокиназа также связывается с митохондриями - возможно, с их наружной мембраной. Распределение гексокиназы между растворенной и связанной с митохондриями формами, по-видимому, модулируется гормонами или метаболитами. Во всех этих случаях смысл ассоциации перечисленных ферментов, а возможно, и других растворимых ферментов с мембраной, состоит в "канализации" субстрата. Например, переносимый через внутреннюю митохондриальную мембрану АТР должен более эффективно утилизироваться гексокиназой, локализованной около мембраны. Однако это предположение пока нельзя считать окончательно доказанным.

В ряде работ показано, что гликолитические ферменты связываются с экспонированным в цитоплазму кислым доменом белка полосы 3 мембраны эритроцитов. В число этих ферментов входят альдолаза, фосфофруктокиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. Предполагается, что в некоторых случаях связанный с мембраной фермент может оставаться в неактивной форме и быстро переходить в активную цитоплазматическую форму в присутствии соответствующих метаболитов. Пока неясно, правда, происходит ли такая ассоциация in vivo или это артефакт, связанный с работой in vitro. Взаимодействия между белками в таких ассоциатах относительно слабые и зависят от ионной силы. Такая же картина характерна для некоторых предполагаемых ассоциатов ферментов с митохондриальной мембраной. Однако сопряжение гликолитических функций с мембранными активностями и компартментализация этих ферментов, вообще говоря, слишком привлекательная концепция, чтобы ее отбрасывать, тем более что для других систем существование таких ассоциатов доказано.

Получить убедительные доказательства физиологической значимости взаимодействия этих ферментов и ферментных ансамблей с мембраной довольно трудно, но есть основания полагать, что в недалеком будущем в этой области исследований будет достигнут определенный прогресс.

Еще один класс взаимодействующих с мембраной растворимых белков представляют цитотоксины.

6.5 Факторы свертывания крови - внеклеточные ферменты, активируемые связыванием с мембраной

Свертывание крови происходит в результате сложного каскада реакций с участием целого ряда факторов сыворотки. В ходе этих реакций осуществляется последовательная протеолитическая активация серии зимогенов, каждый из которых, активировавшись, в свою очередь вызывает активацию одного или нескольких других зимогенов. Конечным результатом всех этих реакций является превращение фибриногена в фибрин. Для осуществления многих этапов этого каскада необходимо, чтобы активированная протеаза и/или субстрат-зимоген связалась с мембраной тромбоцитов, эндотелиальных или иных клеток. Особый интерес представляют следующие вопросы:

1) как белки связываются с мембранами? 2) какую роль играет мембрана в активации участвующих в свертывании крови ферментов? Окончательных ответов на эти вопросы пока нет.

Всем связывающимся с мембранами факторам свертывания крови необходимы кислые фосфолипиды. Некоторые из них, в частности факторы VII, IX, X и протромбин, требуют также Са2+. С участием витамина К происходит модификация этих четырех белков - карбоксилирование в ^-положении остатков глутамата, локализованных в гомологичных N-концевых участках каждого из полипептидов. В результате такой модификации в молекуле белка формируется значительное число высокоаффинных центров связывания Са2 +, который в свою очередь необходим для соответствующего взаимодействия белков с кислыми фосфолипидами на мембране. Каким образом Са2+ облегчает белково-мембранные взаимодействия, не совсем ясно. Это может быть, в частности, "сшивание" с помощью Са2+ белка с гидрофильными отрицательно заряженными головками фосфолипида. Кальций необходим не для всех факторов свертывания крови. Так, фактор V может непосредственно взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфолипидами, а другой компонент, так называемый "тканевый фактор", вообще является интегральным мембранным белком. Большей частью, однако, факторы взаимодействуют с поверхностью бислоя за счет электростатических сил, хотя иногда наблюдается и некоторое проникновение белка в гидрофобную область мембраны.

Присутствие фосфолипидов сильно меняет стационарную кинетику реакций протеолитической активации. Резко уменьшается значение Км для белкового субстрата; например, для реакции активации фактора X фактором 1Ха Км изменяется от 181 до 0,058 мкМ. Добавление другого белка, фактора Villa, увеличивает Kma* более чем в 200 000 раз. Поскольку реакция катализируется обоими ферментами, а субстрат в данных условиях измерения представлен как мембраносвязанной, так и свободной формами, истинный механизм влияния липида в таких реакциях определить чрезвычайно сложно. Например, показано, что протеолитическая активность фактора X увеличивается при связывании его с мембраной, в то время как фактор IX одинаково активен в свободном и в мембраносвязанном состояниях. Фактор X можно также активировать комплексом фактора Vila и тканевого фактора. В этом случае протеолитическая активация фактора X происходит, только когда он находится в свободной форме в растворе и не связан с мембраной. Другой пример - активация протромбина фактором Ха. Наблюдаемое в этом случае низкое значение Км коррелирует с концентрацией субстрата и протромбина на поверхности фосфолипидной везикулы. Если же добавить кофактор - фактор Va, образующий с фактором Ха комплекс, - то всякая зависимость Км от поверхностной концентрации протромбина на везикуле исчезнет. В заключение отметим, что данная система очень сложна, и роль липидов здесь отнюдь не сводится лишь к созданию соответствующей поверхности, на которой происходит простое концентрирование компонентов системы.

Факторы свертывания крови входят в группу Са2 +-зависимых липидсвязывающих белков. Функции этих белков не всегда бывают известны; некоторые из них связаны с цитоскелетом. Фосфолипазы, к рассмотрению которых мы сейчас перейдем, также являются Са2 +-зависимыми ферментами.

6.6 Фосфолипазы - растворимые ферменты, катализирующие расщепление мембраносвязанных субстратов

Фосфолипиды служат субстратами многих растворимых ферментов, в том числе фосфолипаз. Среди них лучше всего изучена фосфолипаза Аг, которая катализирует гидролиз фосфолипидов по положению sn-2 с образованием жирной кислоты и лизофосфолипида. Фосфолипаза Аг была выделена сначала из ядов кобры и гремучей змеи, а затем из поджелудочной железы быка и свиньи. Это очень близкие по первичной структуре небольшие белки с мол. массой около 14 000. Для некоторых ферментов удалось получить с высоким разрешением трехмерные структуры, также обладающие высокой степенью гомологии. Ферменты из поджелудочной железы синтезируются как неактивные зимогены, которые затем активируются протеолизом: от зимогена отщепляется семь остатков с С-конца.

Фосфолипаза Аг представляет особый интерес с точки зрения мембранной энзимологии, поскольку она обладает способностью активироваться при взаимодействии с интегрированными формами субстрата, например с мицеллами или бислоем. На Рис.6.8 представлена зависимость от концентрации субстрата скорости гидролиза короткоцепочечного фосфатидилхолина фосфолипазой Аг и его предшественником из поджелудочной железы свиньи.

Данный субстрат в концентрациях до 1,5 мМ является мономером, но при дальнейшем увеличении концентрации формирует мицеллы. И зимоген, и активированный фермент очень медленно гидролизуют субстрат в мономерной форме, но как только фосфолипид начинает образовывать мицеллы, активность фосфолипазы А2 резко возрастает.

Активации фосфолипазы агрегированными субстратами было посвящено множество работ, а которых исследовалась кинетика катализируемого ферментом гидролиза субстратов в мономерной форме, в чистых липидных мицеллах, в смешанных мицеллах с тритоном Х-100, в монослоях на поверхности раздела воздух-вода и в фосфолипидных везикулах. Для проявления каталитической активности ферменту во всех случаях нужен Са2 +, причем центр связывания единственного иона Са2+ можно выявить с помощью рентгеноструктурного анализа. В отличие от факторов свертывания крови фосфолипаза Аг не содержит остатка - у-карбоксиглутаминовой кислоты и для ее активации не требуются кислые фосфолипиды.

Для объяснения механизма активации фосфолипаз предложено несколько гипотез

В ряде работ было показано, что связывание фермента с мицеллами или бислоями предшествует стадии активации, при которой резко возрастает число оборотов фермента, и экспериментально эти две стадии можно разделить. Такое поведение ничем не отличается от поведения других рассмотренных липидзависимых ферментов. Несмотря на обилие данных по кинетике, связыванию и структуре фосфолипазы, исследователи не пришли к единому мнению о том, что происходит с ферментом при его активации в присутствии липидного бислоя или мицелл. В литературе рассматривается несколько возможных механизмов.

Фермент связывается с бислоем с помощью специального "участка узнавания поверхности раздела", отличного от активного центра, и для его формирования необходим Са2 +. Предполагается, что этот участок проникает в глубь мембраны. Эта модель основана, в частности, на данных по специфическому влиянию химической модификации N-концевого участка полипептида на взаимодействие с агрегированными субстратами. Происходящая при взаимодействии участка узнавания с мембраной активация фермента, по-видимому, обусловлена конформационными изменениями белка. Следует отметить, что в кристаллическом виде ферменты из поджелудочной железы быка и свиньи представляют собой мономеры, в то время как фосфолипаза Аг из яда гремучей змеи является димером. Обнаруживаемый в мономерных фосфолипазах участок, который, как предполагают, является "участком узнавания поверхности", в димерном ферменте недоступен из водной фазы и находится на поверхности межсубъединичного контакта.

Двухфосфолипидная модель предполагает существование в ферменте двух или более центров связывания фосфолипидов и основана прежде всего на кинетических данных по активации фермента фосфолипидами в смешанных мицеллах. Эта модель позволяет учесть роль агрегации двух или более молекул фермента как важнейшей части схемы активации, а также роль возможных конформационных изменений в увеличении каталитической активности.

Постулируется, что конформация фосфолипидного субстрата в агрегированном состоянии отличается от конформации мономерной формы, и именно с этим связана более высокая скорость гидролиза агрегированных форм липидов ферментом.

4. Увеличение активности связано с тем, что из мицелл или бислоя продукты гидролиза удаляются легче. Кроме того, само по себе накопление продуктов уже приводит к увеличению активности фосфолипазы Аг, хотя механизм этого явления неясен.

Одна из проблем, возникающих при анализе процесса активации, состоит в том, как разделить процессы связывания с липидом и активацию липидом. В экспериментах с однослойными фосфолипидными везикулами удалось выяснить, что критическим параметром для обоих стадий является физическое состояние бислоя. Показано, например, что фосфолипаза А2 лучше всего связывается с дипальмитоилфосфатидилхолином в фазе геля, причем Са2 + для этого не нужен. Для активации же фермента в такой системе, по-видимому, требуется Са2 +, причем в случае везикул фосфатидилхолиновый бислой должен обладать дефектами упаковки и в нем должны происходить структурные флуктуации, подобные тем, которые имеют место в ходе термоиндуцируемого фазового перехода. Взаимодействия молекул белков могут быть важны как для связывания, так и для активации. В некоторых условиях активированный фермент сохраняет активность по крайней мере в течение 30 мин.

Характеристики

Тип файла
Документ
Размер
9,16 Mb
Тип материала
Предмет
Учебное заведение
Неизвестно

Список файлов реферата

Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6572
Авторов
на СтудИзбе
297
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее