Vstupitelnii referatL (645998), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Полученные одним из способов фрагменты нуклеиновых кислот в дальнейшем встраивают в векторные молекулы.

Подводя итог изложенному, можно сделать вывод, что получение генов протективных белков возбудителей представляет собой достаточно сложную задачу. Однако ее решение необходимо для создания в конечном счете рекомбинантных противовирусных вакцинных препаратов.

1.2. ВЫБОР ВЫСОКОАКТИВНОЙ И ХОРОШО ИЗУЧЕННОЙ В

ИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ МОДЕЛИ ВЕКТОРА-НОСИТЕЛЯ И КЛОНИРОВАНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ГЕНА

1.2.1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключается во встраивании фрагментов ДНК, среди которых находится интересую­щий нас участок ДНК, в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы) - плазмидные или вирусные ДНК, которые могут быть перенесены в клетки про- или эукариот и там автономно репли-цироваться. На следующем этапе проводится отбор тех клеток, кото­рые несут в себе рекомбинантные ДНК (с помощью маркерных призна­ков, которыми обладает сам вектор), и затем индивидуальных клонов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы, специфичные для данного гена или участка ДНК).

При решении ряда научных и биотехнологических задач конст­руирование рекомбинантных ДНК требует также создания систем, в которых обеспечивается максимальная экспрессия клонируемого гена.

Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторные молекулы. В первом случае 3'-концы фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью (например, поли (Т)). 3'-концы ли­нейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комп­лементарной ей гомополинуклеотидной последовательностью (то есть по­ли (А)). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплемен­тарного спаривания искусственно полученных "липких" концов.

Во втором случае "липкие" концы создаются с помощью расщеп­ления молекул ДНК (как векторной, так и содержащей интересующий нас фрагмент) одной из эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы характеризуются исключительно высокой специ­фичностью. Они "узнают" в ДНК последовательность из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них строго определенные межнуклеотидные связи. Поэтому даже в ДНК больших размеров рестриктазы вносят ограниченное число разрывов.

Третий способ представляет собой комбинацию двух первых, когда липкие концы ДНК, образованные рестриктазой, удлиняются синтетическими последовательностями (рис. 1).

Концы фрагментов ДНК можно превратить в "липкие", наращи­вая их двутяжевыми олигонуклеотидами ("линкерами"), в состав кото­рых входит участок узнавания рестрикта-

Рисунок 1. Схема конструирования рекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз PstI и поли(G)- поли(С)-линкера.

зой. Обработка такого фраг­мента данной рестриктазой делает его пригодным для встраивания в векторную молекулу ДНК, расщепленную той же рестриктаэой. Часто в качестве "линкера" применяются полинуклеотидные фрагменты, ко­торые содержат специфические участки сразу для нескольких рестриктаз (их называют "полилинкерами").

После встраивания чужеродной ДНК в вектор их ковалентное сшивание осуществляется ДНК-лигазой. Если же размер бреши в рекомбинированной молекуле превышает одну фосфодиэфирную связь, она застраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарирующих систем клетки.

1.2.2. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ РНК

Получение рекомбинантных РНК обычно осуществляют методами ферментативного или химического лигирования РНК. Кроме того, недавно появилась принципиально но­вая возможность встраивания сегмента РНК в заданное положение других молекул РНК с помощью рибозимов.

Ковалентное сшивание отдельных сегментов РНК при получении рекомбинантных молекул, как правило, осуществляют с помощью Т4 РНК-лигазы. Т4 РНК-лигаза закоди­рована в геноме бактериофага Т4. Ее выделяют из клеток E.coli, зараженных этим фагом. Фермент сшивает друг с другом однотяжевые олиго- и полирибонуклеотиды. Для работы Т4 РНК-лигазы необходим источник энергии - аденозинтрифосфат. На рис. 2 приведена схема ферментативного лигирования двух коротких олигонуклеотидов. Как видно из этой схемы, акцептором в реакции лигирования служит пол­ностью дефосфорилированный, а донором - полностью фосфорилированный по концевым нуклеотидным остаткам олигонуклеотид. Это предотвращает возможность сшивания однотипных олигонуклео­тидов.

Эффективность ферментативного лигирования достаточно длинных полирибонуклеотидов сильно варьирует и ее трудно предсказать исходя только из нуклеотидной последовательности сегментов РНК. Наилучшие результаты получены в тех случаях, когда сшиваемые концы полирибонуклеотидов были пространственно сближены за счет комплементарного связывания соседних с ними участков РНК.

Недавно было установлено, что протяженные сегменты РНК (длиной в 200-300 остатков) могут быть с высоким выходом сшиты Т4 ДНК-лигазой. При этом "стыковка" сегментов осуществляется с по­мощью олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного 3'-концу одного сегмента и 5'-концу другого.

Метод химиче­ского лигирования основан на активации концевой фосфатной группы одного из двух сшиваемых сегментов РНК водорастворимым карбодиимидом или

Рисунок 2. Схема сшивания двух олигорибонуклеотидов с помощью Т4 РНК-лигазы.

BrCN. В случае BrCN реакция про­текает очень быстро и не сопровождается модификацией нуклеотид­ных остатков, хотя под действием карбодиимидов фосфодиэфирная связь образуется с более высоким выходом. Для того, чтобы обеспечить сближенность сшиваемых концевых нуклеотидных остатков в фрагментах РНК, было предложено использовать олигодезоксирибонуклеотиды, комп­лементарные обоим фрагментам в месте их стыка.

Химическое лигирование РНК, как правило, проходит с существенно меньшим выходом, чем ферментативное. Однако оно позволяет получать рекомбинантные РНК с необычными типами межнуклеотидной связи (например, пирофосфатной) и необычными нуклеотидными остатками в месте стыка двух фрагментов.

Получение рекомбинантных РНК с помощью рибозимов основано на обратимости реакции самосплайсинга (при отсутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов). Это предоставляет возможность для встраивания интронной РНК в заданный участок другого сегмента РНК (рис. 3). Фрагмент РНК, в который производится встраивание, должен содержать нуклеотидную последовательность, идентичную нуклеотидной последова­тельности 3'-концевого участка 5'-экзонного района 26S РНК и соот­ветственно комплементарную той нуклеотидной последовательности в интроне, которая отвечает за специфичность прямой реакции. Фраг­мент, в который производится встраивание, берется в избытке.

В настоящее время описанная здесь цепь реакций может быть реализована только для интронной РНК, получаемой из предшест­венника 26S РНК тетрахимены. Однако можно думать, что конструи­рование новых рибозимов может существенно расширить возможности этого подхода.

1.2.3. СТРАТЕГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ

Векторные молекулы в обязательном порядке содержат маркерные гены, которые после переноса вектора в клетки-реципиенты сообщают им новые свойства. Это может быть устойчивость к антибиотику, которой до трансформации клетки не обладали, или образование фермента, синтез которого в клетках-реципиентах не происходил. Благодаря таким вновь приобретенным признакам клетки с векторными ДНК могут быть легко найдены в популяции исходных клеток. Одновременно могут быть отобраны те клетки, которые содержат векторы со встроенными в них чужеродными ДНК (рекомбинантные ДНК). Для этого встраивание чужеродной ДНК в вектор производится таким образом, чтобы один из маркерных признаков вектора нарушался. Так, например, если бактериальный вектор несет устойчивость к двум антибиотикам, то чужеродную ДНК встраивают в один

Рисунок 3. Схема прямого и обращенного процесса самосплайсинга.

из генов антибиотической устойчивости. И тогда бактерии с рекомбинантной ДНК, в отличие от бактерий с исходным вектором, могут расти в присутствии только одного из антибиотиков.

Другой весьма распространенный пример связан с наличием в векторной ДНК наряду с генами, сообщающими клетке устойчивость к антибиотикам, фрагмента лактозного оперона, обеспечивающего об­разование в клетках-реципиентах активного фермента -галактозидазы. Колонии клеток с таким признаком легко обнаруживаются при выращивании их на твердом агаре, содержащем в качестве субстрата -галактозидазы 5-бром-4-хлор-3-индолил--галактозид (X-gal), по­скольку его расщепление приводит к образованию бромхлориндола - красителя, окрашенного в голубой цвет. Если же в ген -галактозидазы этого вектора встроена чужеродная ДНК таким образом, что этот ген оказался нарушенным, то трансформированные им клетки будут обра­зовывать бесцветные колонии. Само же присутствие рекомбинантного вектора в клетках может быть зафиксировано по их устойчивости к антибиотику.

На следующем этапе среди популяции клеток с рекомбинантными векторами необходимо отобрать индивидуальные клоны, содержа­щие только интересующие нас гены или их фрагменты. Само собой разумеется, что это в принципе возможно только в том случае, если в исходные клетки проникло в среднем по одной молекуле рекомбинантной ДНК. Способ же отбора клонов в значительной степени зависит от природы клонируемого гена.

По-видимому, самым простым является случай, когда клониру­емый ген способен комплементировать ауксотрофную мутацию в штамме-реципиенте. В этом случае клетки высеваются на среду, ли­шенную вещества, необходимого для роста данного штамма, и только клетки, содержащие рекомбинантную ДНК с искомым геном, способны расти на этой среде. Из таких клонов получают гомогенную культуру клеток, которую используют для получения искомого сегмента ДНК, проделывая все операции в обратном порядке (то есть из клеток выделяют вектор, из него вычленяют необходимый фрагмент ДНК и так далее).

Гораздо чаще для отбора необходимых клонов приходится при­бегать к методу ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. Для этого необходимо располагать "зондами" (индивидуальными молекула­ми ДНК или РНК или их фрагментами), комплементарными нуклеотидной последовательности клонируемого гена. Это могут быть специ­ально синтезированные олигодезоксирибонуклеотиды длиной в 15-20 остатков, последовательность которых выбрана на основании полно­стью или частично известной первичной структуры гена или закодиро­ванного в нем белка. Это могут быть кДНК, синтезированные на инди­видуальных РНК-копиях данного гена (как таковые или в виде отклонированных, то есть существенно умноженных в количестве фрагментов ДНК). Наконец, это могут быть сами индивидуальные РНК, закодированные в данном гене. Ясно, что во всех случаях "зонды" должны нести радиоактивную метку (обычно ³²Р) с достаточно высокой удельной активностью.

Если же индивидуальный "зонд" недоступен, то применяют методы, которые из большого числа рекомбинантов (10⁶) позволяют выбрать сравнительно небольшую группу (около 10²), включающую рекомбинант с искомым геном. Эта группа подразделяется на подгруп­пы (например, на 10) по 10 рекомбинантов. Из каждой подгруппы выделяется ДНК, которую используют для синтеза мРНК и последу­ющей трансляции ее с целью обнаружения соответствующего продукта искомого гена.

Трансляция мРНК может быть осуществлена в бесклеточной системе. Однако в случае эукариотических генов мРНК часто перено­сят в ооциты лягушки (ксенопуса) с помощью техники микроинъек­ции, где она транслируется. Продукт трансляции обычно обнаружива­ют с помощью антител.

Далее в подгруппе, где обнаружен искомый ген, тем же методом исследуется каждый клон.

При наличии зонда с чашки Петри, на которой выращены колонии клеток, делается отпечаток (реплика) на нитроцеллюлозном фильтре. Клеткам дают вырасти на фильтре, затем их разрушают, подвергают ДНК щелочной денатурации и фильтр прогревают при 80°С, после чего ДНК необратимо с ним связывается. Фильтр отмыва­ют от примесей и обрабатывают радиоактивным "зондом" в условиях, оптимальных для ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. После удаления избытка "зонда" методом ауторадиографии определяют поло­жение клеточного клона, содержащего участок ДНК с нуклеотидной последовательностью, комплементарной "зонду". Этот клон становит­ся затем источником клеток для получения искомого гена или его фрагмента.

Для селекции клонов, несущих необходимый ген, достаточно широко применяются и иммунологические методы. Принцип отбора на первых этапах тот же, что и при использовании ДНК- и РНК-зондов. Далее с колоний с рекомбинантными ДНК делается реплика с помощью полимерной пластинки, на которой закреплены антитела к продукту искомого гена. Положение клонов, вырабатывающих этот белок, опре­деляется также с помощью антител, но уже меченных радиоактивным йодом (¹²⁵I).

Характеристики

Список файлов реферата