Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родов и 30 видов, встречающихся на всех континентах. Наиболее широко они распространены в Северной и Южной Америке, Африке, Австралии. Представители семейства рясковые являются самыми маленькими в мире цветковыми растениями, венчики которых редко превышают 1 см. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции всех своих органов, поэтому и по простоте строения занимают первое место среди цветковых.

Рясковые – водные, свободноплавающие, большей частью многолетние травянистые растения. По своей природе рясковые являются неотеническими формами произошедшими от предков современного водоплавающего рода Пистия из семейства Ароидных. Рясковые служат кормом для диких и домашних уток, а так же других водоплавающих и болотных птиц, для рыб, особенно карпа, и ондатры. В сельском хозяйстве их используют в свежем и сушеном виде как ценный белковый корм для свиней и домашней птицы. Применяются рясковые и для очистки воды, так как извлекают из нее и запасают в своих листьях азот, фосфор, калий, а так же поглощиют углекислый газ и обогащают воду кислородом. Употребляются и человеком.

За последние 50 лет рясковые рассматриваются, как чрезвычайно ценный экспериментальный объект для морфогенетических, физиологических и биохимических исследований благодаря неприхотливости к среде, малым размерам, быстрому росту, что позволяет использовать всего один генетический клон на протяжении всего эксперимента.

1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК

Экспрессию генов vir-области индуцируют специфические сигнальные молекулы посредством позитивной регуляции системы в состав которой входят гены virA и virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].

Активаторами транскрипции vir-генов являются низкомолекулярные моноциклические фенольные соединения, синтезируемые в механически поврежденных тканях растений [Stuchel, 1985]. Примерами таких соединений являются ----------- и довольно широкий круг производных ------- биосинтетического пути метаболитов защитной природы или предшественников лигнина.

Сигнальные молекулы были впервые обнаружены в экссудатах корней и листьев двудольного растения Nicotiano tabacum, они были идентифицированы как ----- и -------. Эти соединения синтезировали метаболически активные поврежденные ткани растений. В настоящее время установлена сигнальная индуцирующая активность у большой группы ------- соединений растительной природы. Механическое повреждение тканей растений приводит к усилению синтеза таких сигнальных соединений. Известно, что ------------ и коричная кислоты, проявляющие сигнальную активность, обладают так же антимикробными свойствами и являются промежуточными метаболитами на пути синтеза -------. ---------- распознаются специфическими рецепторами агробактерий, являющимися трансмембранными хеморецептргыми белками с различной ------- к таким молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальной индукции экспрессии генов vir требуется присутствие в эксцудатах растений различных углеводов: глюкозы, глюкуроновой кислоты, галактозы, галактуроновой кислоты, арабинозы, маннозы, фукозы, целлобиозы и ксилозы, представляющих компоненты клеточной стенки растений. Такие углеводы связываются с периплазматическим доменом рецептора в виде предварительно обработанного комплекса с белком-продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причем конечный результат индукции процессинга тДНК зависит от синергической активности сигнальных соединений и сахаров эксцудатов растений.

Структурная формула:

Позитивная регуляторная система vir A – vir G, контролирующая экспрессию генов vir -----, работает следующим образом. Экспрессируемый конститутивно ген vir A выполняет функцию рецепции сигнальных молекул растений и трансмиссии этого сигнала в бактериальную клетку. Этот мембранный хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена vir G, который в свою очередь выступает в качетве позитивного регулятора собственной транскрипции и транскрипции остальных генов vir -----. Механизмы активации следующие.

Белок vir A, дважды пронизывающий мембрану бактерии, при появлении сигнальных молекул автофосфорилируется --------- на своем С-конце, переходя в активную форму. (В отсутствии индукции С-терминальный домен белки vir A взаимодействуют с W-терминальным доменом, ингибируя киназную активность).

Активированный белок vir A в свою очередь --------- внутренний клеточный белок – трансдуктор сигнала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al., 1990]. Фосфорилированный белок vir G связывается с промоторами остальных генов регулона и со своим собственным, выступая в качестве транскрипционного активатора. Индукция vir генов обратимая, и каскад реакций может быть прерван, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин больной и нежизнеспособный организм, перенос тДНК в его клетки не осуществляется [Hess et al., 1991].

Кроме позитивной регуляторной системы vir A – vir G, локализованной на Ti-плазмиде, в регуляции экспрессии vir-генов принимают участие также хромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного хромосомного мутанта ros, у которого гены vir C и vir D – оперонов экспрессируются в отсутствие сигнальных молекул растений.

3. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1. Оборудование

Копалка, термомиксер 5436, центрифуга "Эппиндорф", прибор для горизонтального электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.

2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.3. Растения

В качестве объектов исследования использовали двух–, трехмесячное однодольное растение ряски крошечной (Lemna perpusilla).

Растения выращивали в теплице в вегетационных сосудах при температуре 18–25⁰ С и 12 часовом световом периоде. Относительную влажность воздуха в теплице поддерживали в пределах 65–70%. Для анализа брали стерильные ткани листьев. Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5–10 минут, а затем материал 3 раза промывали стерильной водой и использовали в экспериментах по индукции vir–генов Ti–плазмид. Для сравнения были взяты двудольные растения табака красного и льна долгунца.

2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений

В работе использовали среды:

1. Для микроорганизмов – LB (Лурия–Бертани)

рН 7,5

Температура 24⁰ С

Длина светового дня 16 часов

На чашку Петри:

1. Для культивирования растений – среда MS (Мурасиге–Скуча) приведена в таблице.

2.1.5. Другие растворы

Фосфатный буфер

ТЕ буфер (10 мМТрис–HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА)

Саркозилат Na

Проназы – 1,5 мг/мл

Фенол

Хлороформ

Агарозные гели

Фитогормоны:

БАП (6–бензиламинопурин) растворяли в растворе 0,1 – NaOH

HУК (2–нафтилуксусная кислота) растворяли в этаноле и разводили водой до 10 мг/мл. Стерилизовали фильтрованием через фильтры В 485.

Ацетосирингон растворяли в 70% спирте (этаноле) в концентрации 10 мг/мл. Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ.

2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии

Гидролиз ДНК проводили рестрикционными эндонуклеазами:

Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.

2.1.7. Антибиотики

Ампицилин 50, Н₂О 50. Для селекции бактерий с определенными плазмидами.

1. Методы

2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений

Ночную культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), выращенную на ротационном шейкере (20 циклов/мин) при 29⁰ С в жидкой среде LB, собирали центрифугированием и суспензировали в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН 5,5) до кислотности А600 – 0,05.

После 5 часов роста в бактериальную культуру добавляли мелконарезанные стерильные ткани растений (листья, стебли) в количестве 2 г на 10 мл среды и продолжали инкубацию в течение 48 часов.

В качетве положительного контроля использовали агробактериальную культуру с добавлением в качестве индуктора 100 мкМ ацетосирингона. В качестве отрицательного контроля использовали агробактериальные клетки, выращенные на среде без ацетосирингона и эксцудатов растений.

Эффективность индукции процессинга тДНК церез 48 часов инкубации агробактерий с тканями растений. Титр жизнеспособных бактерий после инкубации с эксцудатами растений проверяли путем их высева в различных разведениях на чашки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов проводили в трех повторностях.

2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens

ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт.Через 48 часов совместного культивирования агробактерий с тканями растений из пробирок удаляли растительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g. Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин при 37⁰ С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА), содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы. Лизат дважды экстрагировали фенолом и дважды хлороформом. ДНК осаждали спиртом и растворяли в ТЕ–буфере.

2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну

В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий в количестве 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорез при 25–100 В в течение 2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА и 5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК фага , гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind III. Блод–гибридизацию проводили на ––––– фильтрах. В качестве зонда использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– с помощью ДНК–полимеразной системы.

2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli

Штаммы E. сoli HB101 выращивали в жидкой среде LB при 37⁰ С до концентрации 5*10⁷ клеток/мл (А600 = 0,45). Для количественного изучения процессинга тДНК использовали комплементарные клетки бесплазмидного штамма E. сoli HB101, которые трансформировали тотальной ДНК агробактерий, которая была выделена (М-2), претерпевших различную переработку. Трансформанты каждого варианта высевали на три чашки Петри с агаризированной средой LB, содержащей ампицилин (50 мкг/мл). Количество колоний подсчитывали. В контрольных экспериментах клетки трансформировали плазмидой pBR322, и другой контроль не был подвергнут трансформации и колоний обнаружено не было.

3. результаты

Для обнаружения процессинга агробактериальной тДНК, индуцированного экссудатами анализированных растений, в работе применяли метод "спасения плазмиды", предложенный Koukolikova-Nikola с соавт. Этот метод основан на использовании модифицированной Ti-плазмиды pGV385 [11], содержащей между правой и левой границами значительно делетированной исходной тДНК бактериальной плазмиды вектор pBR322. Таким образом, индуцирование процессинга тДНК в модифицированной Ti-плазмиде pGV3850 можно прослеживать по вырезанию из нее низкомолекулярного фрагмента ДНК, в состав которого входит плазмида pBR322. Этот процесс можно тестировать различными методами. Один из них – это трансформация клеток E. сoli тотальной агробактериальной ДНК и отбор трансформантов по селективным маркерным признакам плазмиды pBR322 – устойчивой к антибиотикам. Другим методом может быть блод-гибридизация – анализ тДНК с помощью плазмиды pBR322 в качестве гибридизационного зонда. Оба этих метода были использованы в настоящей работе. Сравнили эффективность индукции процессинга экссудатами различных растений проведено по отношению к активности 100 мкМ ацетосирингона. Известно, что это токсифенольное соединение, выделяемое некоторыми двудольными растениями, принадлежит к сигнальным молекулам, индуцирующим вырезание и перенос агробактериальной тДНК.

Результаты трансформации клеток E. сoli НВ101 тДНК подвергнутых воздействию экссудатов листьев различных растений представлены в таблице.

Таблица 3.1.

Экссудаты листьев ряски индуцировали вырезание тДНК, что является доказательством присутствия в их составе сигнальных соединений, специфических для индукции транскрипции генов vir агробактериальной Ti-плазмиды.

Прямой блод-гибридизационный анализ тДНК агробактерий свидетельствует о присутствии у ряски сигнальных молекул, индуцирующих образование тДНК [12].

Характеристики

Список файлов реферата