94620 (613131), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Недолік поверхневого способу – необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими важко механізувати. Собівартість культури гриба-продуцента висока, причому в основному через витрати великої кількості ручної праці. Механізація процесу вирощування можлива шляхом забудівлі безперервнодіючих установок або бескюветних апаратів з вертикальним товстим шаром живильного середовища та інтенсивним продування повітря через цей шар.
Глибинну культуру мікроорганізмів вирощують на рідкому поживному середовищі при енергійної аерації в герметично закритих апаратах та в стерильних умовах. Процес повністю механізований. Стерильність глибинної культури мікроорганізма – продуцента ферментів позитивно відбивається на результатах зброджування сусла дріжджами [2, 28].
Культура, що виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні, представляє собою корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних міцелієм, що зрісся. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм. Культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40оС, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
6.2 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з глибинних культур мікроорганізмів
Для отримання амілолітичних ферментних препаратів у нашій країні переважно використовується глибинний спосіб культивування. У цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі. Технічно більш досконалий, ніж поверхневий, так як легко піддається автоматизації та механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні, зазвичай, значно нижче, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.
Підготовка живильного середовища: головним джерелом вуглецю для всіх продуцентів α-амілази є крохмаль різного походження, який вводиться в середу в клейстерізованому стані. Може використовуватися і крохмалевмісну сировину. Біосинтез α-амілази протікає більш інтенсивно, якщо крохмаль частково гідролізувати, не допускаючи накопичення в середовищі низькомолекулярних вуглеводів наприклад гідролізат крохмалю. Склад живильного середовища може включати й інші різні вуглеводвмісні речовини: гідролізат крохмалю, кукурудзяної муки, кормових дріжджів, лужний екстракт кукурудзяної муки. Неорганічні речовини: (NH4) 2HPO4, CaCl2, MgSO4, KCl. Деякі компоненти попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обсіменіння об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації та апарати. Повітря очищається до і після аерування. До – тому що містить частинки пилу органічної та неорганічної природи, після – тоу що несе клітини продуцента [2, 6, 29].
Одержання посівного матеріалу: для засіву живильного середовища матеріал готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій - молода зростаюча культура на початковій стадії спороутворення. Одержання посівного матеріалу полягає в збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується лише вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне спороношення – скорочується до 1%.
Посівний матеріал як на окремих стадіях, так і готовий піддають ретельному мікробіологічний контроль. Він не повинен бути інфікований сторонньою мікрофлорою, в ньому має міститися певна кількість спор або клітин на одиницю маси, генетично закладені в ньому властивості продукувати ферменти повинні стійко зберігатися [30].
Біосинтез ферментів в глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервної подачі повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах можуть гальмувати зростання біомаси продуцента, тому часто свіжа середу або деякі її компоненти вводяться в ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворилися метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять в комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкращу якість продуктів.
Відомі наступні різновидності глибинного культивування: періодичний, безперервно-циклічний і безперервно-проточний.
1. Періодичний спосіб характеризується незмінність живильного середовища в ферментера, склад якої в процесі розвитку поступово змінюється. Процес протікає постадійно: у ферментер набирають живильне середовище і задають посівний матеріал; після розмноження мікроорганізмів і накопичення продуктів їх обміну зрілу культуру вивантажують, а все обладнання, комунікації та запірні пристрої пормивають, а потім стерилізують парою.
2. При безперервноциклічному способі мікроорганізми, розташовані на нерухомої насадці у ферментері, омиваються середовищем, що протікає в замкнутому контурі, до повного споживання ними поживних речовин. Після цього зрілу культуру вивантажують, починаючи з останнього, апарати промивають, стерилізують і цикл повторюють з останнього голів ¬ ного ферментера. Багата поживними речовинами середу під час такої циклічної ферментації поступово виснажується; за часом перебування середовища в зоні реакції цей процес більш тривалий, ніж періодичний.
3. Безперервно-проточний спосіб культивування мікроорганізмів більш досконалий. Суть його полягає в тому, що мікробна популяція розвивається в проточному поживному середовищі. Спосіб має два різновиди: гомогенно-неперерваним і градієнтні-безперервний. У першому випадку вирощування ведуть в одному ферментері; при ретельному перемішування середовища та аерації забезпечується однакове стан культури в усьому об'ємі рідини. У ферментер при цьому не безперервно надходить свіжа середи, а з нього також безупинно випливає надлишок зрілої культуральної рідини.
4. Градієнтні-безперервне культивування здійснюють в батареї ферментера, з'єднаних переточні трубами. Середовище, що засівають, з великим вмістом вуглеводів і інших інгридіентів безупинно перетікає з одного ферментера в інший і також безперервно витікає у вигляді готової культури.
Безперервним культивуванням у проточних середовищах можна вирощувати мікроорганізми в умовах, оптимальних для їх стадії розвитку. При цьому такі важливі фактори, як концентрація поживних речовин, кількість продуктів обміну, рН, вміст розчиненого кисню, різко змінюються при періодичному способі культивування, підтримуються по стояли на заданому рівні або змінюються по розробленній програмі.
Виділити: У міцелії тридобовий культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в навколишнє клітини рідку середу. У цьому випадку препарати ферментів виділяють з фільтратів після відділення біомаси.
Концентрування: для отримання ферментних препаратів з індексом Г3х фільтрат або культуру концентрують, після чого суміш направляється на сушіння. Глибинні культури мікроскопічних грибів в рідкому вигляді не можуть зберігатися тривалий термін без втрати активності, перевозити їх на великі відстані внаслідок значного вмісту в них води (до 85 ... 90%) також економічно не завжди виправдано. Тому при організації постачання культурою спиртових заводів доцільно її попередньо концентрувати.
Концентрування культур можна здійснювати на вакуум-випарних установках з отриманням сиропів при температурах, що забезпечують збереження ферментів, або на розпилювальних сушарках з отриманням порошкоподібного ферментного препарату. Однак ці способи супроводжуються значними втратами активності (до 50%) і тому не знайшли поширення на спиртових заводах. Починаючи з сімдесятих років у ВНІІПрБТ був розроблений і впроваджений на Мічурінському експериментальному заводі спосіб концентрування глибинних культур ультрафільтрації.
Спосіб заснований на проведенні процесу фільтрації через ряд напівпроникних мембран, в результаті чого ферменти та інші високомолекулярні речовини затримуються або виводяться з апарату у вигляді ультраконцентрату (концентрованого сиропу). Вода і частина низькомолекулярних речовин (пермеат) проходять через мембрани і також видаляються.
Втрати активності при ультрафільтрації складають до 15% в перерахунку на первинну активність вихідної висвітленої культуральної рідини.
При використанні концентрованих препаратів на стадії оцукрювання застосовують звичайне обладнання для фармакотерапевтичної групи ферментних оцукрюючих матеріалів [30].
Очищення: для отримання очищених ферментних препаратів використовують традиційні методи, що дозволяє більш ніж у 30 разів підвищити активність препарату. Для відділення амілаз від супутніх ферментів використовується адсорбція домішок на глинистих матеріалах, зокрема на бентоніт. Одним із прийомів очищення термостабільним амілаз від протеаз є термоінактівація останніх. Також використовуються методи біоспеціфіческой хроматографії на природних і синтетичних сорбентах.
Сушка: висушування препарату повинне здійснюватися за температури на вході в розпилюючи сушарку не вище 100-120 ° С, на виході – не більше 50-60 °С. При сушці і концентрування велике значення має правильний вибір стабілізатора ферменту. Введення стабілізаторів у присутності наповнювачів (перліту та каоліну) в процесі розпилювального сушіння дозволяє практично повністю запобігти теплову інактивацію ферментів [30].
6.3 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з поверхневих культур мікроорганізмів
При поверхневому методі культура росте на поверхні твердої зволоженою живильного середовища. Міцелій повністю обволікає і досить міцно скріплює тверді частинки субстрату, з якого отримують поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середу повинна бути пухкої, а шар культури-продуцента невеликим.
Підготовка живильного середовища: середовищем для вирощування продуцентів є пшеничні висівки з додаванням до 25% солодових паростків, зволожених водою, подкисленной 0,1 н. розчином сірчаної або соляної кислоти. Вихід готової культури складає звичайно 70-80 мас. % Від маси середовища. Пшеничні висівки - джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до висівками можна додавати буряковий жом, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середу гострим паром при помішуванні (температура - 105-140 С, час 60-90 хвилин). Після цього середу засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають в растільние камери.
Одержання посівного матеріалу: продуцентами α-амілази і глюкоамілази найчастіше є бактерії B.subtilis і B.amilosolvents. Вирощування виробничої культури відбувається зазвичай в асептичних умовах, але середовище та кювети необхідно простерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування. Переваги поверхневої культури: значно більш висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при оцукрювання крохмалю 5 кг поверхневої культури замінюють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.
Посівний матеріал може бути трьох видів:
- Культура, що виросла на твердому живильному середовищі;
- Споровий матеріал;
- Міцеліальних культура, вирощена глибинним способом.
В три етапи отримують і посівну культуру. Спочатку музейну культуру продуцента пересівають на 1 - 1.5 г зволожених стерильних пшеничних висівок в пробірку і вирощують в термостаті до рясного спорообразованія. Другий етап - аналогічно, але в колбах, третій - у судинах з 500 г середовища.
Виробниче культивування: режими вирощування залежать від фізіології продуцента. Культивують протягом 36-48 годин. Зростання ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій і їх проростання (температура не нижче 28 º С), потім зростання міцелію у вигляді гармата сірувато-білого кольору (необхідно виводити виділяється тепло) та освіта конідій. Для створення сприятливих умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримання оптимальної вологості (55-70%).
Виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура представляє корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних зрослися міцелієм. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм.
Виділення та очищення: процес очищення починається з водної екстракції при 20-25 ° С з відбором 20-22% розчину; середня концентрація СВ в екстрактах - 11-14%. Екстракт може бути використаний для отримання очищених препаратів шляхом осадження ферментів органічними розчинниками або солями. Амілази випадають в осад майже повністю (93-96%) при концентрації етанолу в розчині 69-72%, ацетону - 60-62 і ізопропанол - 54-55%. Як правило, екстраген - вода. При цьому в розчин переходять цукру, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення і очищення завершує сушка.
Сушка: культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40 º С, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
Стандартизація: стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін [2, 30].
7. МЕТОДИКИ ВИЗНАЧЕННЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ АКТИВНОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
Як правило, ферменти присутні в біологічних об'єктах в мізерно малих концентраціях, тому більший інтерес представляє не кількісний вміст ферментів, а їх активність по швидкості ферментативної реакції (по убутку субстрату або накопичення продуктів).
Для визначення ферментативної активності ферментів застосовуються такі методи, які дозволяють безперервно стежити за ходом перетворення у часі: спектрофотометричні методи, потенціометричні, полярографічні і т.п. Для вимірювання швидкості ферментативної реакції необхідно вибрати буфер, який не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близької до оптимальної для даного ферменту. Реакцію проводять при температурі, що лежить в більшості випадків в межах 25-40 º С. При дослідженні ферментів, що вимагають присутності кофакторів (іонів металів, коферментів та ін), концентрація яких може знижуватися в міру очищення ферменту, в реакційну суміш слід додавати відсутні кофактори, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і т.п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори до складу досвідчених сумішей[31].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
