92192 (612931), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Другие вирусы идентифицируют методом непрямой иммуно-флуоресценции. Подобным образом определяют и РСВ. Однако в тех случаях, когда клинические симптомы и характер ЦПД не позволяют отнести вирус к той или иной группе, необходимо исследовать клеточный гомогенат под электронным микроскопом. Подобным образом время от времени следует исследовать и клеточные культуры, используемые в рутинной работе, для исключения случайной вирусной инфекции.
В табл. 2 представлены основные группы болезнетворных вирусов, клеточные линии для их выделения, а также способы выявления и идентификации.
Таблица 2. Чувствительные клеточные линии, способы выявления и идентификации наиболее распространенных вирусов, вызывающих заболевания человека
| Вирусы | Чувствительная клеточная линия | Выявление и идентификация |
| Аденовирусы Вирус Коксаки А Вирус Коксаки В Цитомегаловирус Эховирусы Вирус простого герпеса Вирус гриппа А и В Вирус кори Вирус свинки Вирус парагриппа Полиовирусы Респираторно-синцитиальный вирус Риновирусы Вирус краснухи Вирус ветрянки | пэч ГШ» пп ФЛЭЧ пп ФЛЭЧ пп пп, пэч пп пп пп Нер-2 ФЛЭЧ RK-13 ФЛЭЧ | ЦПД, НТ ЦПД, НТ ЦПД, НТ ЦПД, ЦПД, НТ ЦПД, НТ, ИФ ГА, ТГА, ИФ ЦПД, НТ, ИФ ГА, ТГА ГА, ТГА, ИФ ЦПД, НТ ЦПД, НТ, ИФ ЦПД, НТ ЦПД, НТ, ИФ ЦПД |
5. Иммунологические методы
Существует множество методов качественного и количественного определения вирусоспецифических антител. С помощью этих методов можно обнаружить как IgM и IgG одновременно, так и отдельно иммуноглобулины каждого класса. Как правило, в реакции связывания комплемента выявляются только вирусоспеци-фические IgG. Однако при тестировании этим методом микробиологических антигенов возможно одновременное определение специфических IgM и IgG.
Иммунологические методы используются главным образом в двух целях: во-первых, для диагностики текущей, завершившейся или врожденной вирусной инфекции и, во-вторых, для обнаружения специфических антител, присутствие которых указывает на прошедшую инфекцию и, следовательно, на иммунитет к возможной повторной инфекции. По силе иммунного ответа на вирусную инфекцию люди сильно отличаются друг от друга. На рис. 3 показана типичная кривая нарастания титра
антител в ответ на первичную инфекцию краснухи. Легко заметить, что установление диагноза краснухи возможно по нарастанию титра специфических IgG и выявлению специфических IgM. Присутствие специфических IgM в крови новорожденного свидетельствует о внутриматочном инфицировании, поскольку материнские IgM в отличие от IgG задерживаются плацентой. Специфические IgG, образовавшиеся в результате первичной инфекции, обычно сохраняются в течение всей жизни. Поэтому присутствие антител этого класса в сыворотке крови свидетельствует об иммунитете к соответствующей повторной инфекции.
Ниже приведены иммунологические методы обнаружения специфических антител к вирусу краснухи, особенно эффективные для диагностики заболевания плода и определения титра специфических антител в сыворотке крови. Подробные описания методов, используемых для диагностики краснухи, можно найти в обзорах Паттисона и Моргана-Капнера.
5.1 Реакция торможения гемагглютинации
Вирус краснухи вызывает гемагглютинацию эритроцитов многих видов животных. Чаще всего в РТГА используют эритроциты однодневных цыплят. Гемагглютинирующим антигеном вируса краснухи при постановке этой реакции служит выращенный в культуре и обработанный Твин 80 и эфиром вирус. Предварительная обработка увеличивает ГА-титр вируса.
5.1.1 Стандартизация ГА-антигена вируса краснухи
1. 1 мл 50%-ной суспензии эритроцитов цыплят трижды промывают в вероналовом буфере с декстраном и желатином центрифугированием и ресуспендированием осадка в 15-мл градуированной центрифужной пробирке. Отмытые клетки ресуспендируют в DGV-буфере для получения 30%-ной суспензии.
Таблица 3. Приготовление вероналового буфера с декстраном и желатином
| 1. DGV-буферный раствор Таблетки буфера для реакции 20 связывания комплемента Веронал натрия 400 мг Желатин 1200 мг Дистиллированная вода 2000 мл Растворяют таблетки в дистиллированной воде. Добавляют веронал натрия и желатин. Помещают в водяную баню при 56 °С до полного растворения желатина. Разливают во флаконы по 100 мл. Автоклавируют и хранят при 4 °С |
| 2. 25%-ный БСА БСА, фракция 5 25 г Стерильная дистиллированная 100 мл вода Стерилизуют фильтрованием, разливают по 1 мл в стерильные ампулы. Хранят при —20 "С |
| 3. 10%-ная глюкоза Глюкоза 10 г Дистиллированная вода 100 мл Разливают по 1 мл. Автоклавируют и хранят при 4 °С |
| 4. Для использования DGV-буферный раствор 100 мл 25%-ный БСА 0,8 мл 10%-ная глюкоза 1,0 мл Хранят при 4°С |
2. Разводят лиофилизированный препарат ГА-антигена вируса краснухи в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды.
3. В каждую из восьми лунок двух соседних рядов 96-луноч-ного полистиролового планшета для микротитрования с U-об-разными лунками вносят по 1 объему DGV.
4. В первые лунки двух рядов вносят по одному объему ГА-антигена вируса краснухи.
5. Готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена вируса краснухи, начиная от 1:2 и до 1:256, используя 0,025-мл микротитратор. Перед употреблением головку микро-титратора следует прокалить в пламени докрасна, затем остудить в течение нескольких секунд, поместить в дистиллированную воду и промакнуть фильтровальной бумагой.
6. В каждую из заполненных лунок дополнительно вносят по одному объему DGV-буфера. В качестве контроля в лунки 12 первых двух рядов вносят по два объема DGV-буфера.
7. Суспензию отмытых эритроцитов цыплят разводят в 100 раз DGV-буфером, получая таким образом 0,03%-ную суспензию.
8. Во все 18 лунок добавляют по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов, готовый планшет закрывают другим, неиспользованным планшетом и инкубируют 1 ч при 4 °С.
9. На дне контрольных лунок образуется плотная «бляшка» неагглютинированных эритроцитов. Агглютинированные эритроциты оседают равномерно. ГА-титром считают обратную величину наибольшего разведения ГА-антигена вируса краснухи, при котором еще происходит полная агглютинация. Такое разведение содержит 1 гемагглютинирующую единицу.
Для тестирования сывороток используют 4 ГА-единицы антигена вируса краснухи. Таким образом, если ГА-титр антигена равняется 32, то для обнаружения антител к вирусу краснухи его разводят DGV в восемь раз. Разведенный антиген стабилен в течение 25—48 ч при 4 °С.
5.1.2 Предварительная обработка сыворотки
Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемаг-глютинации, которые следует удалить. Неспецифические ингибиторы ГА в основном представляют собой липопротеины, от которых освобождаются, обрабатывая сыворотку каолином. В сыворотках человека, кроме того, могут присутствовать неспецифические агглютинины куриных эритроцитов. Однако предварительная адсорбция тестируемых сывороток эритроцитами не является обязательной, поскольку все неспецифические гемагглютинины, присутствующие в сыворотках, обнаруживаются в контролях.
1. В стеклянные пронумерованные пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. Кроме исследуемых сывороток в каждом опыте необходимы положительные и отрицательные контроли.
2. В каждую пробирку добавляют по 0,8 мл 25%-ного каолина на боратно-солевом буфере.
3. Содержимое пробирок взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин.
4. Отработанный каолин осаждают центрифугированием в настольной центрифуге при 2000 об/мин 20 мин.
5. Супернатант переносят в чистые пронумерованные пробирки. В результате очистки получают сыворотки, разбавленные в четыре раза. Их используют для постановки реакции торможения гемагглютинации. Сыворотки можно хранить при 4 °С в течение ночи.
5.1.3 Реакция торможения гемагглютинации
1. Для тестирования одного образца сыворотки вносят по одному объему DGV в один ряд лунок.
2. В первую и последнюю лунки добавляют по одному объему сыворотки, разведенной в четыре раза.
3. С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки.
4. В лунки 1—10 вносят по одному объему ГА-антигена краснухи, содержащего 4 ГАЕ. В лунку 12 ГА-антиген краснухи не добавляют.
5. В лунки 1—8 другого планшета вносят по одному объему рабочего разведения ГА-антигена краснухи, и затем в восьми лунках готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена. В эти 16 лунок добавляют по одному объему DGV. Это титрование является проверочным для ГА-антигена краснухи. Для контроля в лунки 12 первого и второго рядов вносят по два объема DGV.
6. Закрытые планшеты оставляют на 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.
7. Во все заполненные лунки вносят по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов цыплят и планшеты оставляют на 1 — 1,5 ч при 4 °С.
8. Просматривая планшеты, определяют титр ГА-антигена краснухи. В контрольных лунках агглютинация не должна произойти.
9. Если же сыворотка агглютинировала эритроциты в отсутствие ГА-антигена краснухи, необходимо провести повторное тестирование исходного разведения сыворотки. Перед этим сыворотку адсорбируют одной каплей 30%-ной суспензии эритроцитов цыплят 1 ч при комнатной температуре, а затем эритроциты осаждают центрифугированием.
10. Титром специфических антител в исследуемой сыворотке считают обратную величину разведения, при котором полностью подавляется гемагглютинация.
5.1.4 Интерпретация результатов
При невысоком титре интерпретировать результаты сложно, так как при небольшом разведении возможно остаточное присутствие неспецифических ингибиторов. Наличие вирусоспецифических антител считается доказанным при титре 16 или выше.
5.2 Реакция связывания комплемента
Принцип реакции связывания комплемента основан на том, что взаимодействие антител с вирусными антигенами приводит к активации, а следовательно, к связыванию комплемента. Остающийся комплемент можно обнаружить, используя эритроциты барана, сенсибилизированные антиэритроцитарными антителами. Эти антитела обычно называют гемолизинами и получают из сыворотки кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Несвязавшийся комплемент вызывает лизис эритроцитов. В случае связывания комплемента в первой реакции лизиса эритроцитов барана не происходит.
Таким образом, количество специфических антител в сыворотке можно определить при тестировании ее последовательных разведений с известным микробиологическим антигеном в присутствии комплемента и с последующим добавлением сенсибилизированных эритроцитов барана.
Для получения достоверных воспроизводимых результатов необходимо строго соблюдать пропорции используемых реагентов. Поэтому перед постановкой реакции необходимо определить соответствующие концентрации комплемента, гемолитической сыворотки и антигена. Ниже мы приводим пример определения специфических антител к вирусу краснухи в РСК-
5.2.1 Титрование комплемента и гемолитической сыворотки
Здесь так же, как и в РТГА, используют полистироловые 96-луночные планшеты с U-образным дном и микротитратор
Постановка реакции
1. Растворяют в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды лиофилизированный препарат комплемента.
2. Нумеруют восемь стеклянных пробирок.
3. Готовят 60-кратное разведение комплемента в первой пробирке. Для этого 0,1 мл комплемента разводят 0,7 мл дистиллированной воды и 4,0 мл вероналового буферного раствора. Лиофилизированный комплемент содержит криопротектор, поэтому добавление 0,7 мл дистиллированной воды к 0,1 мл растворенного комплемента дает 10-кратное разведение.
4. В оставшиеся семь пробирок вносят по 0,4 мл VBS.
5. 1,6 мл содержимого первой пробирки переносят во вторую, перемешивают, затем из второй переносят 1,6 мл в третью и т.д. до восьмой пробирки. Перед каждым переносом пипетку промывают в VBS. Таким образом получают последовательные разведения комплемента с 20%-ной разницей между ними, т.е. 1:60, 1:75, 1:94, 1:118, 1:148, 1:184, 1:230, 1:288.
6. Размечают 96-луночный планшет, как указано на рис. 5.
7. В лунки 1—8 рядов 1—7 вносят по два объема VBS.
8. В лунки 9 рядов 1—6 вносят по три объема VBS.
9. В лунки 1—8 рядов 1—7 добавляют по одному объему приготовленных разведений комплемента.
10. Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4°С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
