11460 (600563), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Втрата хромосом у гібридів між клітинами миші і людин - це випадковий процес. Те, яка хромосома збережеться і стабілізується в гібридній лінії, випадковий процес. Однак із усієї популяції гібридних клітин можна відібрати стабільні лінії, які містять бажані гени і хромосоми, використовуючи селекційні методи. Ці процедури аналогічні тим, що використовуються для добору певних класів рекомбінантів, які утворяться при схрещуваннях бактерій або дріжджів.
Відсутність у батьківської лінії мишачих клітин якої-небудь істотної функції, наприклад здатності синтезувати необхідний метаболіт, може бути супресовано при внесенні елементів геному людини. З такої гібридної лінії можуть поступово втратитися всі людські хромосоми, крім тієї, котра містить ген, відповідальний за незамінну функцію. Таким чином, можна відібрати гібридні клони, які містять конкретні людські хромосоми. Такий попередній добір полегшує картування генів, розташованих у цій хромосомі.
Один дуже широко використовуваний метод добору гібридних кліток називається НАТ-селекцією. Це назва-абревіатура англійських назв речовин: гіпоксантина, аміноптерина і тимідина, які присутні у селективному середовищі. Аміноптерин блокує синтез пуринів і піримідинів. Для того щоб синтезувати ДНК, клітини повинні реутилізувати пурини і піримідини, які утворяться при деградації полінуклеотидів. В обміні нуклеотидів бере участь велика кількість ферментів. Один з цих ферментів - тимідинкіназа (ТК), яка здійснює перетворення тимідину в тимідинмонофосфат. Якщо у мутантній лінії клітин миші, яка використовується відсутній цей фермент, то на селективному середовищі HAT, в якому відсутній тимідинмонофосфат, можуть рости клітини, які одержали хоча б одну з гомологічних хромосом людини, які містять ген ТК. Цитологічні дослідження показали, що всі клітинні лінії, які відбираються, містять 17 хромосому людини. За допомогою таких клітинних ліній можуть бути картовані й інші гени людини (крім гена ТК), локалізовані на сімнадцятій хромосомі. Задача зводиться до ідентифікації продуктів генів людини, що напрацьовуються у відібраних гібридних лініях.
Селективне середовище HAT може бути використана для добору клонів, які містять і інші хромосоми. Наприклад, фермент фосфорибозил-гіпоксантин-трансфераза (HPRT) бере участь у синтезі пуринів. Якщо лінія кліток миші втрачає здатність синтезувати HPRT, то цей дефект може бути відшкодований присутністю відповідного гена людини. Показано, що всі гібридні клони, відібрані за цією ознакою, містять людську Х-хромосому, у складі якої знаходиться ген HPRT. Розроблено інші селективні схеми, що дозволяють проводити картування генів, локалізованих і на інших хромосомах, крім X і 17.
2.3 Внутрішньохромосомне картування генів за допомогою хромосомних перебудов
Ідентифікація індивідуальної хромосоми, у якій знаходиться досліджуваний ген - це тільки перший етап картування. Основною задачею є встановлення порядку генів і їхня точна локалізація. У деяких випадках метод аналізу родоводів дозволяє розташувати на генетичній карті хромосоми три і більш маркерів. Використання більш ефективних методів генетики соматичних кліток може дати більш точну інформацію. Істотна допомога в таких дослідженнях належить хромосомним перебудовам.
Ген, який кодує кислу фосфатазу 1 (ACPI) еритроцитів, розташований на другій хромосомі. При цитологічному вивченні каріотипів двох дітей (із двох різних родин), у яких були множинні уроджені аномалії, далося показати наявність делецій термінальної області короткого плеча другої хромосоми. В одного з дітей делеція хромосоми починалася з термінального району смуги 2р23. Культура клітин, отриманих від цієї дитини, мала ACPI-активність. Ці клітини несли алель А в одній з гомологічних хромосом і аллель В в іншій. У другої дитини делеція захоплювала і проксимальний район смуги 2рЗЗ. Клітини, які містять таку хромосому, були позбавлені активності цього ферменту. Таким чином, можна зробити висновок, що ген ACPI локалізований у смузі 2р23.
У клітинах, які культивуються часто виявляються хромосомні перебудови, відсутні в індивідуумів, які служили донорами вихідних клітин. В інших випадках перебудови, наприклад транслокації, уже присутні в мутантних організмах.
Зміна рівня нагромадження ферменту може допомогти картувати відповідний дуплікований ген. Ген GOT1, який кодує розчинну глутамат-оксалацетат—трансаміназу, розташований у 10 хромосомі. Були ідентифіковані дві клітинні лінії, у яких фрагмент хромосоми 10 був транслокований на хромосому 17 або 21. Крім того, у клітин, які досліджувались була збережена і вихідна хромосома 10. Лінія з транслокацією 10/21 характеризується рівнем активності GOT, у порівнянні з контрольним, який має дві нормальні хромосоми і не має дублікованих сегментів. Лінія з транслокацією 10/17 характеризується рівнем активності GOT, приблизно на 50% більшим, ніж в інших ліній. От чому припускають, що лінія з транслокацією 10/17 містить три копії гена GOT. Цей ген повинен бути локалізований на сегменті хромосоми 10, який присутній у транслокації 10/17, але не 10/21.
2.4 Мікроклітини й ізольовані хромосоми
Селекція за типом HAT і інші способи дозволяють одержувати стабільні клітинні лінії, які несуть індивідуальні людські хромосоми. Існують більш прямі методи, які дозволяють одержувати гібридні клітинні лінії, які містять певні компоненти геному людини. Це гібридизація кліток миші з мікроклітинами людини, які несуть неповний геном, і ендоцитоз мишачими клітинами ізольованих хромосом людини.
Мікроклітини являють собою хромосоми, оточені ділянками ядерної і плазматичної мембран. При рості клітин у присутності колцеміду через кілька днів ядро розпадається на кілька мікронуклеусів, кожний з яких містить тільки одну або кілька хромосом. Ці клітини обробляють цитохалазином і центрифугують. Таким чином, відокремлюється фракція мікроклітин, які являють собою мікронуклеуси, оточені тонким шаром цитоплазми, укладеної між ядерною і плазматичною мембранами. Цитологічні методи дозволяють визначити, які саме хромосоми містять отримані мікроклітини. Плазматична мембрана зберігає рецептори для вірусу Сендай, що дозволяє проводити гібридизацію кліток миші з отриманими мікроклітинами, використовуючи цей вірус. Лінії кліток, які утворяться в результаті гібридизації, несуть визначені людські хромосоми. Гени людини, які експресуються в отриманих гібридних лініях, можуть бути, таким чином, віднесені до визначених хромосом.
Препарат хромосом людини, який не містить домішки клітин, може бути отриманий при відповідній обробці, яка розкриває плазматичну і ядерну мембрани клітини. У сімдесятих роках були розроблені методи фракціонування і проточної мікрофлуориметрії, які дозволяють здійснювати сортування хромосом на фракції, які містять індивідуальні хромосоми людини високої чистоти. Коли вільні хромосоми додають до клітин миші, які культивуються, то ці клітини можуть захоплювати цілі хромосоми в процесі ендоцитозу. Всередині реципієнтної клітини захоплені хромосоми звичайно деградують, розпадаючись на фрагменти. Якщо такі фрагменти містять центромерні області, то вони можуть підтримуватися як єдине ціле. Фрагменти, позбавлені центромери, можуть транслокуватися на мишачі хромосоми. У тому і іншому випадку визначені людські гени будуть експресуваться в гібридних клітинах. Вбудовування фрагментів у хромосому миші відбувається з дуже низькими частотами, від 10-4 до 10-7 на клітину. Фрагменти, які вбудовуються, можуть бути як дуже дрібними, не видимими у світловий мікроскоп, так і досить великими, включаючи плечі хромосом і навіть цілі хромосоми. Такий перенос генетичного матеріалу від донора, який супроводжується вбудовуванням у хромосоми реципієнта, називається трансформацією (як у бактерій) або трансфекцією.
Картування генів у визначених областях хромосом може бути зроблене в тому випадку, якщо експресію досліджуваного гена можна тестувати у трансформованій клітині, а убудований фрагмент хромосоми ідентифікується цитологічно. При аналізі трансфікованих фрагментів даної хромосоми, які розрізняються за величиною, можна визначити синтенію та порядок генів. Природно, це можливо тоді, коли гени, відсутні в малих фрагментах, виявляються при вбудовуванні фрагментів більшого розміру .
Крім такого прямого підходу, порядок генів і їхнє відносне зчеплення можна вивчати за частотами котрансформації цих генів. Такі експерименти зводяться до виміру частот спільного вбудовування в геном однієї клітини двох різних генів.
2.5 Картування генів за допомогою ДНК-зондів
Методи картування генів, які обговорювалися в попередніх розділах, були засновані на експресії досліджуваних генів у культурах клітин. Гени, які кодують ферменти клітинного метаболізму і гени, які кодують поверхневі антигени, такі, як білки головного комплексу гістосумісності або антигени групи крові, задовольняють цій умові. Гени, які не володіють подібним фенотипічним проявом, не можуть бути картовані лише з використанням описаних методів. Це обмеження вдається перебороти за допомогою методів генної інженерії. При цьому стає можливим картування будь-яких послідовностей ДНК, для яких можна одержати відповідний ДНК-зонд. Ці методи внесли воістину революційний переворот у генетичний аналіз гібридів соматичних кліток.
Перше застосування методів роботи з рекомбінантними ДНК для картування генів людини включало ДНК-гібридизацію в розчині. Таким чином, вдалося картувати гени α- і β-глобінів. Зонди, які представляють собою комплементарні ДНК (кднк) цих генів, були отримані за допомогою зворотної транскрипції очищених α- і β-глобінових матриць. Ці зонди у певних умовах не взаємодіють один з одним або з глобіновими генами миші, але утворять стабільні дуплекси при обжизі з відповідними послідовностями ДНК людини. Глобінові кДНК-зонди використовували для тестування в розчині препаратів ДНК, виділених з різних гібридних клонів. Утворення стабільного дуплекса між кДНК-зондом і ДНК досліджуваного препарату свідчило про присутність людських глобінових генів у геномі відповідної гібридної лінії. Каріологічний аналіз виявлених у такий спосіб гібридних клонів дозволив зробити висновки, що гени β-глобінової родини розташовані в хромосомі 11, а α-глобінові в хромосомі 16.
Для проведення гібридизаційного аналізу в розчині потрібно велика кількість ДНК. Додаткові труднощі пов'язані також з можливістю перехресної гібридизації між гомологічними генами людини і миші. Більшість цих труднощів можуть бути подолані за допомогою блот-гібридизації за Саузерном. На першому етапі відповідний ДНК-зонд мітять радіоактивними ізотопами (такими, як 32Р або 3Н) за допомогою нік-трансляції. Потім з гібридних ліній клітин, які несуть визначені хромосоми людини, виділяють препарати тотальної ДНК. Препарати ДНК обробляють рестрикуючими ендонуклеазами, а отримані фрагменти ДНК розділяють гель-електрофорезом, денатурують і переносять на нітроцелюлозні мембранні фільтри. На фільтрах здійснюється гібридизація з тим або іншими міченими ДНК-зондами. Для більшої ефективності можна розділяти ампліфіковані фрагменти хромосомної ДНК. Для цього використовують їхнє попереднє клонування на фагових векторах.
Після гібридизації фільтри накладають на рентгенівську плівку, на якій після прояву виявляються смуги, які відповідають рестрикційним фрагментам, які містять послідовності ДНК, гомологічні даному зондові . Гени співвідносять з певними хромосомами людини на підставі кореляції між присутністю даної хромосоми в гібридній клітинній лінії і наявністю фрагмента людської ДНК, який гібридизується на радіоавтограмі. Даний метод більш чуттєвий, ніж гібридизація ДНК у розчині і, головне, більш специфічний.
Метод гібридизації по Саузерну, поєднаний з підходами, розробленими для генетичного аналізу соматичних клітин, з успіхом застосовувався не тільки для картування визначених генів, але і для локалізації послідовностей ДНК із невідомими функціям, знайденими в бібліотеках генів людини.
РОЗДІЛ ІІІ. МЕДИЧНІ ТА ЕТИЧНІ АСПЕКТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ГЕНОМУ ЛЮДИНИ
3.1 Пошкодження генів і спадкові хвороби
Варто також звернути увагу на питання, зв'язані з діагностикою, профілактикою і лікуванням спадкоємних захворювань, де аналіз генома стає усе більш діючим і надійним способом визначення хвороби.
Якщо існує тест, що з достатнім ступенем точності дає можливість виявити те або інше захворювання, то чи буде цей тест обов'язковим для всіх, або тестування буде залежати від бажання пацієнта?
З 10 тис. відомих захворювань людини близько 3 тис. спадкові хвороби. Вони необов'язково успадковуються (передаються нащадкам). Просто викликані вони порушеннями спадкоємного апарата, тобто генів (у тому числі в соматичних клітинах, а не тільки в статевих). Виявлення молекулярних причин "поломки" генів найважливіший результат проекту.
Спадковість безпосередньо зв'язана з продовженням роду, але і тут виникає питання про бажання і готовність чоловіка і жінки пройти обстеження перед тим, як завести дитини. Якщо, скажемо, обоє дружина є носіями гена спадкоємного захворювання, то з 25% імовірністю патологічний ген проявиться в дитини. У такому випадку проведення пренетальної діагностики, зв'язаної з виділенням кліток плоду з крові матері, просто необхідно, але тоді, у випадку виявлення патології плоду в свою чергу встає питання про можливості і навіть обов'язковості аборту.
Число вивчених хвороботворних генів швидко росте, і через 34 роки ми пізнаємо всі 3 тис. генів, відповідальних за ті або інші патології. Це допоможе розібратися в генетичних програмах розвитку і функціонування людського організму, зокрема, зрозуміти причини раку і старіння. Знання молекулярних основ захворювань допоможе їхній ранній діагностиці, а виходить, і більш успішному лікуванню. Адресне постачання ліками уражених кліток, заміна хворих генів здоровими, керування обміном речовин і багато інших мрій фантастів на наших очах перетворюються в реальні методи сучасної медицини. Одним з таких є генотерапія.
Основна частина робіт з генотерапії спадкових і інших захворювань орієнтована на одержання коригуючих послідовностей і векторів, їхній перенос і вбудовування в клітини-реципієнти. Для цієї мети випробуються плазмідні і вірусні вектори, балістичні мікроінфузії, трансплантація клітин, оскільки за наявним даним відомо, що для терапевтичного ефекту досить всього 5 - 10% нормально функціонуючих клітин. Серед можливих векторів для доставки коригуючих ДНК до клітин і тканин-мішеней при гемотерапії муковісцидозу розглядаються вірусні, плазмідні, ліпосомні і пептидні конструкції. Однак до клінічних іспитів потрібно ще вирішити непрості питання взаємодії генетичних препаратів з клітинами, стійкості ефекту.
Перспективним методом генотерапії вважається технологія ex vivo, коли клітинний матеріал, взятий від пацієнта, реплантується йому після екстракорпоральної генокорекції. Уже є приклад успішного лікування сімейної форми гіперхолестеринемії з використанням такого підходу.
3.2 Онкогени
Трансформація культур клітин за допомогою ДНК недавно привела до відкриття генів, які беруть участь у канцерогенезі. Ці гени називають онкогенами. Деякі форми ракових захворювань мають явно виражену генетичну природу. Характер спадкування вказує на те, що захворювання може визначатися одним геном. Як приклад подібного захворювання можна привести ретинобластому, яка наслідується по домінантному типі. Це захворювання виявляється в дитинстві як ракова поразка одного або двох очей, що швидко переходить на мозок, що при відсутності лікування приводить до ранньої смерті хворого. Хоча відомі багато видів ракових захворювань, спадкування яких підкоряється законам менделевського розщеплення ознак, усі вони досить рідкі й охоплюють лише незначну частку людей хворих раком. Більш розповсюджені форми раку не мають такої чітко з'ясованої генетичної природи, хоча схильність до них, імовірно, успадковується.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
