11344 (600539), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Спектри поглинання УФ-світла препаратами МВК реєстрували на однопроменевому спектрофотометрі СФ-46.
Для виділення препарату ХВК листя томатів відбирали на 21-25-й день після зараження.
Проводили інфільтрацію в 0,3 М трис-гліциновому буферному розчині, рН 8,3 з додаванням 0,1 %-ного 2-меркаптоетанолу (ME) та 0,01 М ЕДТА протягом 12 годин за температури +4 °С.
Попередня інфільтрація рослинного матеріалу сприяла підвищенню ефективності екстракції вірусу, блокуючи дію ферментів рослинного соку.
Після інфільтрації листя подрібнювали на вальцевому пресі ПВЛ-1 в присутності 0,3 М трис-гліцинового буфера, рН 8,3 у співвідношенні 1:2. Отриманий гомогенат віджимали через капронове сито. Екстракт в трис-гліциновому буферному розчині містив менше пігменту, ніж при використанні фосфатного чи цитратного буферних розчинів, що значно поліпшувало наступні етапи очистки.
Освітлювали екстракт шляхом центрифугування за 15 000 об/хв протягом 20 хв. До надосадової рідини додавали краплями 20 %-ний розчин тритон Х-100 до кінцевої концентрації 0,5% та інкубували 30 хв., не застосовуючи на цьому етапі органічних розчинників, які різко знижують вихід вірусу [11, 12]. Додавання тритон-Х 100 зумовлює розчинення клітинних мембран і хлоропластів перед осадженням поліетиленгликолем (ТТЕГ).
Первинне концентрування вірусу проводили шляхом додавання до екстракту 20 %-ного розчину поліетиленгліколю (м.в. 40000) та NaCl до кінцевої концентрації 8 % та 1,5 %, відповідно. Витримували 1 годину при температурі +4 °С. Преципітат відділяли центрифугуванням за 6000 об/хв протягом 20 хв.
Після центрифугування при 6000 об/хв в надосадковій рідині вірус серологічно не виявлявся. Для повної екстракції вірусу необхідно було проводити декілька послідовних ресуспендувань осаду 0,01 М трис-гліциновим буфером, рН 8,3, кожен раз освітлюючи екстракт низькошвидкісним центрифугуванням. На цьому етапі загальний об'єм отриманого препарату вірусу не перевищував 1/10 від початкового об'єму рослинного екстракту.
Після осадження ПЕГ екстракція ХВК із преципітата, який містить значну кількість білків рослини-хазяїна, ускладнена. Це потребує застосування ряду циклів екстракції вірусу із осадів та контролю на кожному етапі для уникнення значної втрати вірусу. Екстракція МВК з осадів проходить більш ефективно, якщо для гомогенізації рослинної тканини використовувати трис-гліциновий буфер, а не фосфатний чи цитратний. При використанні трис-гліцинового буфера основна кількість вірусу екстрагується при перших двох етапах ресуспендування.
Остаточне очищення препарату ХВК здійснювали за допомогою приладу для препаративного електрофорезу із застосуванням 40%-ної сахарозної подушки.
При проведені препаративного електрофорезу ХВК необхідно було підібрати оптимальні умови для очищення вірусу: рН та іонну силу буферних розчинів, температурний режим, напругу електричного поля, тривалість, концентрацію сахарозної подушки, кількість антигену; який можна розділити [12].
Сконцентрований осадженням ПЕГ препарат вірусу нашаровували на 40%-у сахарозну подушку висотою 10 см та діаметром 1,5 см, яка була сформована в електрофоретичній колонці.
Електрофорез вели в лужній системі буферів за температури 16-20 °С, сили струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в протягом 3 годин.
При відпрацюванні цього етапу отримання препарату МВК виявили, що електрофорез в 40 % сахарозі є ефективним прийомом дляконцентрування ХВК та очищення його від рослинних компонентів.
В роботі ми використовували 0.01М трис-гліциновий буфер, рН 8,3, який найбільше підходить як для екстракції ХВК, так і для електрофорезу. Виходили з того, що буферний розчин, який використовується при електрофорезі, повинен мати низьку іонну силу (0,005-0,02), що дозволяє застосовувати високі градієнти напруги вздовж колонки при мінімальному утворенні тепла. Крім того, мають бути підібрані такі значення рН буферних розчинів, щоб різниця в зарядах між компонентами суміші, яка розділяється, була максимальною [7, 12].
Напругу поля належить підтримувати настільки високою, наскільки можливо за умов мінімального утворення та розсіювання тепла. При розробці нашого методу мінімальний нагрів і конвекцію спостерігали при силі струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в.
Важливим фактором при препаративному електрофорезі в 40%-ній сахарозі є температура: якщо охолодження недостатнє, то це призводить до нерівномірного розподілу фракцій.
Експериментальним шляхом визначали тривалість електрофорезу препарату ХВК. Після 1; 2; 3 годин електрофорезу зразки проби та сахарозної подушки перевіряли методами серології та електронної мікроскопії на наявність антигену. Встановлено, що після трьох годин електрофорезу вірус повністю осідав на поверхні пробки ПААГ.
Візуальне спостереження за перебігом електрофорезу показало, що через 30 хвилин після включення струму від зони проби починають відділятися пластівчасті утворення, які осідають на пробці ПААГ, формуючи ледве помітний шар. Вірогідно, це є агрегати ХВК, які утворилися після осадження ПЕГ і можуть містити залишки клітинного дебрису. При застосуванні диференційного центрифугування сконцентрованого ПЕГ препарату віруси, які перебувають в агрегованому стані, неминуче втрачаються [5], внаслідок чого знижується загальний вихід вірусу. За розробленою нами методикою, агрегати ХВК зберігаються саме завдяки відсутності проміжних циклів диференційного центрифугування.
Електрофоретична рухомість агрегатів у 40 %-ній сахарозі за створених нами умов є вищою за рухомість одиничних часток вірусу; можливо, швидкість міграції агрегатів вірусу збільшується за рахунок сили тяжіння.
Після проходження сахарозної подушки частки вірусу та агрегати утворюють шар на поверхні пробки 10 %-ного ПААГ, яка непроникна для ХВК. Тому, залишаючись на поверхні гелю, антиген додатково піддається електродіалізу, завдяки чому відокремлюються низькомолекулярні домішки рослинного походження. Крім того, під час електродіалізу збільшується розчинність агрегатів вірусу. ХВК переходить у фізрозчин у вигляді препарату достатньо високого ступеня чистоти.
Після закінчення електрофорезу препарат вірусу змивали фізіологічним розчином з поверхні пробки 10%-ного поліакріламідного гелю, яка відділяє робочий об'єм від нижнього електродного буфера. Верхній шар гелевої пробки діставали з електрофоретичної колонки, розтирали у фізрозчині, витримували 12 годин при температурі 4 °С та центрифугували із швидкістю 15000 об/хв. Надосадову рідину аналізували на присутність вірусу, об'єднували із змивом з поверхні ПААГ. Отриманий препарат використовували для проведення електронномікроскопічних та спектрофотометричних досліджень та як антиген для імунізації кролів.
Частина вірусу неминуче адсорбується на поверхні ПААГ, утворюючи нерозчинні комплекси за рахунок гідрофобних та ковалентних зв'язків, але наявність ПААГ в антигені може слугувати ад'ювантом при імунізації тварин, що підвищує титр антисироваток (8).
Препарати ХВК, отримані за розробленим нами методом, як показало електронномікроскопічне дослідження, містили типові для даного вірусу одиничні частки, а також агрегати віріонів з переважанням агрегатів вірусу. Це, на наш погляд, пояснюється відсутністю циклів диференційного центрифугування, коли більшість агрегатів вірусу втрачається.
Очищені препарати М-вірусу картоплі характеризувалися типовим для карлавірусів спектром поглинання УФ-світла з мінімумом поглинання при 247 нм та максимумом - при 270 нм. Вихід вірусу становив 500 мг/кг листя.
Таким чином, поєднання освітлення рослинних екстрактів тритоном Х-100 з наступним осадженням вірусу за допомогою поліетиленгліколю та очищення з використанням препаративного електрофорезом в 40 %-ному розчині сахарози дало можливість отримати чисті препарати ХВК. При цьому є можливість скоротити необхідні об'єми вирощування рослин-накопичувачів вірусів та відмовитися від використання ультрацентрифуг для очищення вірусного антигену. Препарати ХВК, отримані за розробленим методом, характеризуються високим ступенем чистоти та підвищеним виходом вірусу, що робить метод придатним для виготовлення антигену ХВК та отримання специфічних антисироваток. Результати добре відтворюються, що є важливим при виробництві імунодіагностикумів.
3.2 Електронномікроскопічні дослідження апікальних меристем картоплі та вплив хіміотерапії на процес оздоровлення
Більшість районованих сортів картоплі уражені вірусами, які нерівномірно розповсюджуються в рослинах. Так, верхівки пагонів картоплі - меристеми містять безвірусну зону і величина цієї зони варіює залежно від сорту і ступеня ураженості вихідного матеріалу [1]. Цю особливість покладено в основу методу культури апікальної меристеми, який широко застосовується для оздоровлення картоплі. Відомо, що найбільш ефективним способом одержання вільних від вірусів рослин є культивування експлантів розміром не більше 100 мкм [2], але приживлення таких меристем дуже низьке.
Рядом дослідників досягнуто певних успіхів в оздоровленні картоплі шляхом культивування меристем розміром 300-400 мкм. Такі меристеми можуть забезпечити оздоровлення від L, Y, А-вірусів, проте вони не ефективні для оздоровлення від X, М, S-вірусів, які можуть проникати в меристему на різну глибину [3,4].
Найефективнішим способом оздоровлення картоплі є метод із застосуванням культури меристеми в поєднанні з термотерапією і хіміотерапією. Відомо, що вплив антивірусних речовин на звільнення рослин від вірусів у поєднанні з культурою меристеми специфічний. Оздоровлення залежить як від препарату, так і від біологічних властивостей сорту, а також від штамового складу вірусів та комбінаціївірусів у змішаних інфекціях [5,6,7].
За допомогою електронної мікроскопії ультатонких серійних зрізів апікальної меристеми вивчають структуру меристеми картоплі, враженої X-вірусами, визначають рівень локалізації вірусних включень, встановити залежність локалізації вірусів від розвитку плазмодесм.
Досліджування проводились на картоплі сортів Приєкульська рання, Пекуровська, Розара, Синьоглазка, Луговська і Альвара, вражених Х-вірусами в моноінфекції. Рослини вирощували у вегетаційній кімнаті. Перед виділенням меристем проводили тестування імунологічними та електронномікроскопічними методами. Для отримання ультратонких зрізів виділяли меристеми розміром 300-400 мкм, як контроль використовували меристеми безвірусних рослин.
Вивчали локалізацію X-вірусів у стеблових верхівках районованих сортів картоплі (Приєкульська рання, Пекуровська, Розара, Синьоглазка) методом ультратонких зрізів. Меристеми фіксували у 6,5%-ному розчині глютаральдегіда 3 години, 2%-ним OsO4 2 години, проводили дегідратацію в серії спиртів, заливали в ЕПОН-812. Одержували ультратонкі зрізи на ультрамікротомі УМТП-2 з вершини меристеми, серії зрізів (125-250) товщиною 0,005 мкм, після забарвлення 1%-ним розчином уранілацетату та розчином цитрату свинцю за Рейнольдсом [8] досліджували в електронному мікроскопі ЕМ-125. При визначенні розмірів зрізаної меристеми, а також рівня залягання вірусних включень, ураховували ступінь стискання тканин меристеми після заливки (в межах 25 %).
Для діагностування вірусів у меристематичних тканинах використовували експрес-метод, який полягав в тому, що на сіточки-бленди з формваровою плівкою-основою наносили краплю стерильної дистильованої води, в яку занурювали зрізаною основою меристему різних розмірів (від 66 до 375 мкм). Через 30-40 сек меристеми знімали, а препарат контрастували 2 %-ним ФВК, рН 7,0-7,2. Препарати досліджували в електронному мікроскопі при інструментальному збільшенні 20-25 тисяч разів.
В дослідах по оздоровленню методом культури меристеми в поєднанні з хіміотерапією як модельну систему використовували Х-вірус картоплі, слабо- і сильнопатогенні штами на рослинах картоплі різних сортів (Луговська, Альвара). Провели випробування антифітовірусної дії двох нових синтетичних речовин: АВР1 і АВР2. Ці речовини є похіднимиімідазотриазолу.
Досліджували 2 концентрації нових речовин - 0,1 і 0,05 г/л, використовуючи двофазну дію: у першу фазу витримували частинки зелених пагонів картоплі в рідкому розчині антивірусних речовин протягом 2 діб; у другу фазу виділяли експланти розміром 300 - 500 мкм і висаджували їх на поживне середовище з додаванням АВР.
Як контроль під час порівняння ефективності антивірусної дії використовували антивірусний комплекс, який складався із 2,4-діоксогекса-гідро-1.3,5-триазину (ДГТ), ціаногуанідину і розгалуженого манану (РМ) - полісахариду, виділеного із дріжжів роду Candida sp. (клітинні дріжжові манани).
Проводили комплексне тестування отриманих ліній рослин-регенерантів, використовуючи методи імуноферментного аналізу, електронної мікроскопії і рослин-індикаторів.
Електронномікроскопічні дослідження ультратонких зрізів меристемних тканин картоплі дають певне уявлення про розвиток вірусної інфекції в них, а також можливість виявити деякі деталі механізму розвитку інфекції.
При вивченні меристем досліджували такі питання: характер будови та ультраструктурну організацію клітин меристематичної тканини картоплі по зонах; наявність плазмодесм в клітинах на різних рівнях; розподіл і спосіб локалізації вірусних включень у меристематичних клітинах.
Деталі ультраструктурної організації меристемних клітин були встановлені на прикладі сорту Приєкульська рання. В результаті проведених досліджень серій ультратонких зрізів встановлено, що меристемні тканини в зоні 10-15 мкм від верхівки складаються з клітин без вакуолей, цитоплазма має рівномірний гомогенний матрикс із слабо диференційованими клітинними органелами. Починаючи з зони 20-30 мкм вже спостерігається диференціація клітинних органоїдів. З'являються вакуолі, матрикс ядра більш просвітлений. Характерним для цих ділянок тканин є наявність у вакуолях більшості периферійних клітин порівняно великих глобулярних тіл, можливо, саме там накопичуються в клітині рістактивуючі речовини (рис. 2). Ядерця в клітинах, як правило, мали центральні просвітлені зони, які не спостерігалися в ядерцях звичайної листової тканини.
Рис. 2. Глобулярні включення у вакуолях меристематичних клітин. Зона розміром близько 30 мкм від верхівки. Ва - вакуоль, Г - глобули. Збільшення -19000.
Особливий інтерес для розуміння механізм)' проникнення вірусів у клітини меристемних тканин викликає процес формування плазмодесм, які є своєрідними каналами розповсюдження вірусів у звичайних рослинних тканинах. Відсутністю плазмодесм окремі дослідники пояснюють відсутність вірусу в меристемній тканині [9].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
