10612 (600420), страница 3
Текст из файла (страница 3)
В препаратах цитоплазматической РНК мозга также обнаружены короткие молекулы РНК, содержащие ID-последовательность: ВС1, ВС2 и ТЗ. Синтез этих малых РНК осуществляется РНК-полимеразой III, узнающей консервативные участки в ID-последовательности, гомологичные внутреннему промотору генов РНК-полимеразы III. Обнаруженные в клетках эукариот малые РНК, как показано в последние годы, играют важнейшую роль в таких процессах, как сплайсинг и З'-процессинг пре-мРНК, трансляция и трансмембранный транспорт секретируемых белков и т.п.
7. Альтернативный процессинг пре-мРНК в мозге
Альтернативный процессинг заключается в образовании различных зрелых мРНК из одного первичного транскрипта в результате соединения различных комбинаций экзонов и/или использования различных сигналов полиаденилирования. Одним из наиболее хорошо изученных случаев использования альтернативного сплайсинга для образования различных продуктов в разных клетках является система синтеза регуляторных пептидов, кодируемых геном кальцитонина. Этот ген кодирует небольшое семейство пептидов, два из которых (кальцитонин и катакальцин) преимущественно образуются в клетках щитовидной железы, а третий - в клетках нервной системы.
Исследование структуры гена кальцитонина и зрелых мРНК, кодирующих эти пептиды у крысы и человека, показало, что I-III экзоны являются общими для этих мРНК. IV экзон, кодирующий кальцитонин и катакальцин, присутствует только в мРНК кальцитонина и содержит специфический для нее сигнал полиаденилирования, а V и VI экзоны, содержащие CGRP-кодирующую и 3'-некодирующую последовательности, включая специфический для CGRP-мРНК сигнал полиаденилирования, присутствуют только в CGRP-мРНК. Механизмы выбора различных путей сплайсинга первичного транскрипта CT/CGRP-гена в клетках щитовидной железы и нейрона пока еще остаются неясными и сейчас интенсивно изучаются.
Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов обеспечивает также разнообразие белков миелина в ЦНС млекопитающих. В частности, показано, что различные основные белки миелина у мыши кодируются одним геном shi-локуса: при этом белок 21,5 кД кодируется мРНК, содержащей последовательность всех 7 экзонов гена, белок 18,5 кД - всех, кроме II экзона, белок 17 кД - всех, кроме VI экзона, а белок 14 кД - всех, кроме II и VI экзонов. При этом образующиеся белки идентичны по аминокислотным последовательностям, кодируемым общими экзонами.
Еще одним примером служит так называемый РРТ ген крысы, который кодирует препротахикинины а - и р-типов - предшественники целого семейства нейропептидов - тахикининов. Первый из них содержит последовательность вещества Р, а второй - вещества Р и вещества К. Анализ первичной структуры показал, что эти РНК образуются в результате альтернативного сплайсинга по экзонам, кодирующим вещество К.
Разнообразие потенциал-зависимых и лиганд-зависимых ионных каналов в мембранах нервных клеток обеспечивается существованием кодирующих такие каналы мультигенных семейств и опять-таки альтернативным сплайсингом - Один и тот же ген у дрозофилы кодирует четыре полипептидные цепи, участвующие в формировании функционально активного К-канала. Эти полипептиды имеют одинаковые центральные домены, содержащие характерные для потенциал-зависимых каналов элементы.
Как и в описанных выше системах, разные полипептидные цепи К-канала возникают в результате альтернативного сплайсинга одного первичного транскрипта. Для формирования функционально активного К-канала необходима ассоциация четырех одинаковых или разных полипептидов: очевидно, что комбинирование различных полипептидов может обеспечить широкое разнообразие различающихся по физиологически значимым параметрам каналов.
Еще один яркий пример использования альтернативного сплайсинга - образование семейства синаптических рецепторов глутаминовой кислоты. Каждый из четырех рецепторов этого семейства существует в двух вариантах, различающихся лишь коротким сегментом, предшествующим четвертому трансмембранному домену. Согласно существующей топологической модели рецептора этот сегмент имеет цитоплазматическую локализацию. В генах каждого из рецепторов альтернативные варианты 38-ами-нокислотного сегмента кодируются двумя соседними экзонами, а сами варианты рецепторов образуются в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК по этим экзонам. Добавим, что существование альтернативных вариантов для каждого из рецепторов функционально значимо: они имеют различные фармакологические и кинетические свойства и по-разному распределены в отделах ЦНС.
Наконец, роль альтернативного сплайсинга показана при образовании четырех форм тирозингидроксилазы у человека, трех форм ацетилхолинэстеразы в электрическом органе ската, трех форм периферию у мыши, полипептидов у аплизии, специфических для нейрона R15, и в ряде других случаев.
Очевидно, альтернативный сплайсинг является эволюционно древним и широко распространенным в клетках нервной системы способом увеличения качественного разнообразия синтезируемых в них полипептидов.
8. Экспрессия генома и онтогенез мозга животных
Выше уже отмечено, что общее число транскрибируемых в мозге генов в 1,5-2 раза выше, чем во всех остальных тканях, и составляет, по-видимому, несколько десятков тысяч. Многообразие экспрессируемых в целом мозге генов объясняется двумя причинами:
1) разнообразием таковых в каждом индивидуальном нейроне и 2) различиями в наборах генов, экспрессируемых в разных нейронах. Именно налагаясь друг на друга, эти два фактора являются причиной исключительного разнообразия образующихся мРНК и соответствующих белков. Следует подчеркнуть, что разнообразие синтезируемых в любой ткани последовательностей РНК связано преимущественно с относительно редко встречающимися молекулами, которые составляют небольшую долю от общей массы РНК. К мозгу это приложимо в большей мере, чем к любому другому органу или ткани. Поэтому измерения суммарного синтеза РНК и ее общего количества практически не позволяют судить о качественных характеристиках транскрипции генома.
Транскрибируемость уникальных последовательностей ДНК в мозге млекопитающих прогрессивно возрастает в позднем эмбриогенезе и раннем постнатальном онтогенезе, достигая максимума к моменту функционального созревания. Обнаружено, что транскрибируемость генома в различных отделах мозга человека неодинакова: в гностических областях коры больших полушарий она выше, чем в проекционных, в лобной коре левого полушария значительно выше, чем правого, в мозжечке и стволовых отделах мозга уровень транскрипции - промежуточный. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что развитие сложных гностических функций в мозге человека связано с прогрессивным увеличением генетического разнообразия составляющих его клеточных элементов.
В последние годы появились работы, позволяющие сделать прямые оценки степени генетической специализации клеток мозга. Они основаны на исследовании локализации различных мозгоспецифических антигенов с помощью моноклональных антител и локализации индивидуальных мРНК с помощью комплементарных клонированных последовательностей. Главным недостатком этих методов является их низкая представительность: в каждой работе исследуется ничтожная доля от всех синтезируемых в клетках мозга мРНК и белков. Добавим также, что в сфере этих исследований в большинстве случаев оказываются белки и мРНК, присутствующие в мозге в относительно высокой концентрации и уже в силу этого обстоятельства экспрессируемые в обширных популяциях нервных клеток. Так, обнаружены антигены, специфические для основных типов нервных клеток, а также для нейронов определенных отделов мозга. В рамках соответствующих отделов антигены могут иметь еще более выраженную клеточную специфичность. Известны антигены, которые экспрессируются в перекрывающихся популяциях нейронов в одних отделах ЦНС и неперекрывающихся популяциях - в других. Аналогичные, хотя пока и не столь многочисленные данные получены при исследовании локализации мозгоспецифических мРНК гибридизацией in situ. Судя по морфологическим, нейрофизиологическим, нейрохимическим и другим критериям, в мозге млекопитающих минимальными единицами такой специализации являются группы из десятков-сотен клеток, число которых в мозге крысы - 7104, а в мозге человека - 5-107, Это заведомо превышает общее число экспрессируемых в них генов. По-видимому, морфофункциональная специфичность клеток в мозге определяется уникальностью всей комбинации экспрессируемых в них генов и положением этих клеток в специфических нейронных ансамблях. В то же время тот факт, что такие группы насчитывают десятки-сотни клеток с одинаково экспрессируемым геномом, может объясняться необходимостью повышения надежности работы всей системы в целом. Однако в ЦНС некоторых беспозвоночных такая специализация распространяется на индивидуальные нейроны.
9. Экспрессия генов в ЦНС беспозвоночных
С помощью ДНК-РНК-гибридизации показано, что в ЦНС моллюска-кальмара экспрессируется 46% уникальных последовательностей генома, что достаточно для кодирования нескольких десятков тысяч различных мРНК. Следовательно, генетическая сложность клеточных элементов в ЦНС высокоорганизованных беспозвоночных сопоставима с таковой в ЦНС млекопитающих. В отличие от млекопитающих, однако, у кальмара не обнаружено специфической для ЦНС популяции молекул поли+РНК.
Уникальную возможность для исследования экспрессии генов в индивидуальных нейронах представляет ЦНС брюхоногих моллюсков, состоящая из небольшого числа крупных, во многих случаях легко идентифицируемых нейронов, сосредоточенных в нескольких ганглиях. У аплизии некоторые нейроны достигают размеров 0,5 мм и содержат - 0,25 мкг ДНК и - 5 нг поли+РНК, что вполне достаточно для анализа методами молекулярного клонирования.
С помощью процедуры дифференциальной гибридизации клонированы гены и мРНК, специфически зкспрессирующиеся в отдельных нейронах ЦНС аплизии. В их число входят гены, продукты которых хорошо идентифицированы; например ген, кодирующий гормон откладки яиц, и четыре родственных ему гена. Будучи активными в разных нейронах, они кодируют синтез нескольких физиологически активных пептидов, секреция которых индуцирует стереотипный поведенческий репертуар откладки яиц. При этом один и тот же пептид может действовать как нейрогормон на клетки соматических тканей и нейромедиатор на определенные нейроны. Экспрессия других генов этого семейства в клетках атриальных желез приводит к синтезу нейроактивных пептидов, вызывающих активацию сумчатых клеток, а также секретируемых во внешнюю среду пептидов, обладающих активностью половых феромонов. Таким образом, кодируемые этим семейством генов пептиды регулируют различные компоненты одного сложного поведенческого репертуара.
Очень интересен также наплизии, участвующий в регуляции водно-соленого баланса. Он кодирует две мРНК, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга. Одна из них является преобладающим продуктом экспрессии гена в одном из нейронов, тогда как укорочения форма мРНК преимущественно синтезируется в некоторых других нейронах. Следовательно, у аплизии существуют механизмы выбора различных путей сплайсинга в разных нейронах.
Изучение экспрессии генов в индивидуальных нейронах этого моллюска позволяет сделать некоторые принципиальные выводы, которые могут быть применимыми и к ЦНС позвоночных животных. Главный из этих выводов состоит в том, что присутствие множества "редких" молекул РНК в суммарных препаратах поли*РНК, изолированных из целой ЦНС или ее крупных отделов, является следствием активной экспрессии этих РНК в небольших популяциях нервных клеток, а не их экспрессии на одинаково низком уровне в обширных популяциях клеток.
Сравнение популяций мРНК, синтезируемых в нейронах, использующих один и тот же классический медиатор, но функционально различных, показывает, что такие нейроны обычно различаются экспрессией нескольких мРНК, каждая из которых специфична лишь для одного из сравниваемых нейронов. Очевидно, общее разнообразие синтезируемых в ЦНС мРНК складывается из перекрывающихся, но не одинаковых популяций мРНК, образуемых в индивидуальных нейронах. Остается добавить, что рассмотренные исследования охватывают лишь относительно часто встречающиеся молекулы мРНК. Не исключено, что в действительности различия в популяциях синтезируемых мРНК между индивидуальными нейронами носят более сложный характер.
К популярным объектам нейрогенетики из числа беспозвоночных относится и одна из свободно живущих нематод - Caenorhabditis elegans. Одним из важных результатов ее исследования является обнаружение так называемых селекторных генов. Последние играют ключевую роль в онтогенезе нейронов нематоды: их продукты индуцируют включение серии "генов-реализаторов", формирующих фенотип нейронов. Примером селекторного гена может служить ген INS-4, детерминирующий специфичность синаптических контактов идентифицируемого мотонейрона VA. При мутациях этого гена мотонейрон VA образует синаптические контакты, в норме ему не свойственные. Никаких других заметных нарушений в развитии ЦНС при этом не обнаруживается. Продуктом гена INS-4 является гомеобокс-содержащий ДНК-связывающий белок. Очевидно, он регулирует транскрипцию группы генов-реализаторов, непосредственно участвующих в установлении специфических для данного мотонейрона синаптических контактов.
Наконец, классический объект генетических исследований - дрозофила - позволил получить обширную информацию о сложных процессах онтогенеза центральной нервной системы. Эту информацию можно обобщенно представить в виде модели многоступенчатой генетической детерминации нейрогенеза, основные положения которой, по-видимому, сохраняют силу и для позвоночных животных. В соответствии с этой моделью существует четыре класса генов, регулирующих последовательные этапы нейрогенеза. Первый, наименее изученный класс, включает гены, ответственные за преобразование части клеток недифференцированной вентральной эктодермы в предшественники нервных клеток. Ко второму классу относятся гены, детерминирующие свойства клеток-предшественников в соответствии с их положением в той или иной части ЦНС. Среди этих генов - многие из так называемых гомейотических или сегментарных генов, которые детерминируют также и формирование общего плана строений организма в целом. При этом одни и те же гены обычно детерминируют и формирование определенного сегмента организма, и специфические свойства локализованного в нем сегмента ЦНС. Заметим, однако, что сегментарная и нейроспецифическая экспрессия гомейотических генов контролируется разными механизмами. Гены третьего класса детерминируют свойства индивидуальных нейробластов в зависимости от их локализации внутри данного сегмента ЦНС. Представителем этого класса, по-видимому, является ген prospero, экспрессирующийся только в определенных нейробластах каждого сегмента ЦНС, но не в образующихся из них нейронах. Мутации этого гена приводят к выпадению из развивающейся нервной системы нескольких специфических клеточных линий. Наконец, гены четвертого класса детерминируют индивидуальные свойства каждого из нейронов, образующегося при делении одного нейробласта. Представителями этого класса являются гены fushi tarazu и even-skipped. Интересно, что один и тот же ген может участвовать в контроле разных этапов нейрогенеза. Так, ген ftz является типичным гомейотическим геном, участвующим в формировании общего сегментарного плана строения ЦНС и организма в целом, т.е. входит во второй класс генов. На более поздних этапах он участвует в детерминации свойств индивидуальных нейронов: в каждом сегменте ЦНС он экспрессируется в группе из 30 идентифицируемых нейронов, являющихся потомками - 8 нейробластов. При этом ни в одном из нейробластов ген ftz не экспрессируется, а процент экспрессирующих его клеток в потомстве индивидуальных нейробластов варьирует от 0 до 100%. Заметим, однако, что сегментарная и нейроспецифическая экспрессия гена ftz контролируется разными механизмами. Еще один фундаментальный вывод описанных исследований состоит в том, что индивидуальная специфичность элементов нервной системы определяется не уникальными генами, количество которых заведомо меньше числа самих элементов, а уникальными комбинациями взаимодействующих генов, надежность которых обеспечивается чертами функциональной избыточности.
Гены, ответственные за формирование специфического фенотипа функционально зрелых нейронов, изучены главным образом для относительно просто устроенных нейронных структур, например сетчатки глаза дрозофилы. Каждый элемент сетчатки - омматидий - состоит из 8 четко различимых по морфологии и локализации фоточувствительных нейронов и 12 ненейрональных клеток. Дифференцировка нейронов в развивающихся омматидиях протекает в строго фиксированной последовательности. Недифференцированные клетки в зачатках омматидиев являются эквипотенциальными, а судьба дифференцирующихся клеток определяется не их происхождением, а индуцирующими стимулами со стороны соседствующих с ними ранее дифференцированных клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
