10041 (600333), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Резистентность может быть обусловлена также присутствием определенных продуктов метаболизма (внутриклеточных радиопротекторов). Так, Е. coli более резистентна при облучении в присутствии экстрактов из М. radiodurans, чем при облучении в буферном растворе. Защитное действие экстрактов из М. rаdiodurans связано с уменьшением выхода радикалов при участии механизма, аналогичного тому, который действует в отношении известных химических веществ-протекторов.
Своеобразный метаболизм серосодержащих аминокислот у М. radiodurans позволяет думать, что эти аминокислоты выполняют роль сульфгидрильных веществ-протекторов. Зависимость радиорезистентности от концентрации экстракта имеет двухкомпонентный характер: в низких концентрациях он оказывает на тест-организм сенсибилизирующее действие, а в высоких концентрациях — защитное.
Радиорезистентность может определяться уровнем каталазной активности в. клетке. Было показано, что для некоторых бактерий с повышенной радиорезистентностью характерно высокое содержание каталазы.
С возрастанием радиорезистентности увеличивается длина клеток: значительная часть клеток наиболее резистентных штаммов была в 30—40 раз длиннее нормальных. У клеток этих штаммов наблюдалось также своеобразное явление почкования. У резистентных штаммов, упомянутых выше, удлинение клеток было устойчивым признаком, наблюдавшимся в течение трех лет.
К важным факторам, от которых зависит реакция той или иной клеточной системы на любой физический или химический агент, относится состав клеточной стенки. В случае химических мутагенов структура клеточной стенки может определять ее проницаемость, влияя, таким образом, на чувствительность клетки к данному агенту. Хотя структура клеточной стенки не оказывает влияния на проникающую способность ионизирующего излучения, она тем не менее может иметь значение для радиорезистентности микроба. Например, вполне вероятно, что какой-либо связанный с мембраной ферментный комплекс, освобождающийся или активируемый под действием радиации, играет определенную роль в системе (системах) репарации или обусловливает конечную инактивацию клетки. Ионизирующее излучение вызывает освобождение связанной с клеточной поверхностью экзонуклеазы у М. radiodurans. При облучении в дозе 400 крад, сублетальной для этого организма, в клетках остается только 10% фермента, причем степень освобождения фермента зависит от дозы облучения.
Микробы-сапрофиты более устойчивы у световому излучению в сравнении с патогенными. Это объясняется тем, что они чаще подвергаются действию прямых солнечных лучей, поэтому являются более адаптированными (Радчук Н.А., Дунаев Г.В., 1991).
Увеличение содержания ДНК в клетке служит одним из факторов ее радиорезистентности. Это может быть обусловлено либо увеличением числа нуклеоидов в клетке, либо ее полиплоидностью. Нитевидная форма резистентных клеток Е. coli позволяет предполагать, что в них реализуется первый механизм. Но содержание ДНК в клетках этих штаммов практически не отличается от такового в клетках дикого типа.
Определение содержания GC-nap в ДНК восьми видов бактерий показало, что существует обратная зависимость между GC-содержанием и резистентностью клеток к рентгеновским лучам. В то же время между GC-содержанием и резистентностью к УФ-облучению наблюдается прямая зависимость. Такая корреляция утрачивает какой бы то ни было смысл в случае М. radiodurans, резистентного к обоим типам излучения; однако она может иметь некоторое значение при отсутствии у бактерий эффективных систем репарации. Действительно, ДНК М. radiodurans характеризуется тем же нуклеотидным составом, что и ДНК штаммов Pseudomonas, исключительно чувствительных к ионизирующей радиации (Покровский В.И., 1999).
6.1.1 Механизмы репарации ДНК
В основе радиорезистентности бактерий лежат разнообразные внутриклеточные процессы, участвующие в репарации поврежденной ДНК. Большую ценность для исследования этих процессов представляет наличие хорошо охарактеризованных мутантных штаммов, радиационная чувствительность которых варьирует в чрезвычайно широких пределах.
При помощи генетических скрещиваний были получены двойные и тройные мутанты дрожжей, у которых репаративная активность полностью отсутствует. Сравнительное исследование штамма дикого типа и сверхчувствительных двойных и тройных мутантов S. сеrevisiae показало, что если нормальный штамм довольно легко переносит образование в ДНК почти 16 000 димеров (37% выживания), то двойные и тройные мутанты остаются резистентными в присутствии не более 50 и 1 димера соответственно. Пониженная резистентность таких двойных и тройных мутантов служит убедительным свидетельством в пользу существования различных путей репарации радиационных повреждений.
В зависимости от того, участвует ли видимый свет в модификации повреждений ДНК, репарацию можно подразделить на световую и темновую. Конкретно под световой репарацией понимается феномен фотореактивации, впервые описанный у актиномицетов. Механизм фотореактивации действует только на пиримидиновые димеры. В этом процессе участвует фермент фотореактивации, который связывается с димерами. Образующийся фермент-субстратный комплекс активируется видимым светом, что приводит к мономеризации димеров in situ. Таким образом, летальный эффект УФ-облучения существенно снижается, если облученные клетки подвергаются затем воздействию видимого света с длинами волн от 360 до 420 нм (см. рис. 6.1).
Рис. 6.1 Световая репарация ДНК
Фотореактивация служит мощным инструментом исследования летальных и мутационных повреждений, так как их репарация под влиянием света может быть использована в качестве критерия для решения вопроса о том, обусловлена ли инактивация ДНК образованием пиримидиновых димеров.
К другому типу реактивации клеток видимым светом относится его защитное действие. В этом случае увеличение выживаемости клеток наблюдается при освещении их видимым светом перед УФ-облучением. Этот феномен объясняют тем, что видимый свет индуцирует задержку клеточного деления. В результате такой задержки остается больше времени для репарации повреждений, вызываемых УФ-облучением (см. рис. 6.2).
Рис. 6.2 Зависимость выживания клеток бактерий от величины облучения
Под «темновой репарацией» понимают репарацию без участия света. В настоящее время известны две системы такого типа: эксцизионная репарация и пострепликативная рекомбинационная репарация. Репарация первого типа требует присутствия ферментов, которые узнают нарушения структуры ДНК, удаляют затронутые участки, замещая их нормальными нуклеотидными последовательностями, и, наконец, восстанавливают первоначальную структуру ДНК, замыкая полинуклеотидную цепь (см. рис. 6.3).
Рис. 6.3Темновая репарация ДНК
Действие разнообразных инактивирующих агентов на клетки может приводить к возникновению в ДНК целого ряда различных повреждений. Детальное изучение системы эксцизионной репарации стало возможным благодаря наличию радиационно-чувствительных мутантов, с помощью которых удалось выделить и охарактеризовать специфические ферменты, принимающие участие в разных стадиях этого процесса. У Е. coli имеется, по крайней мере, четыре таких этапа. На первом этапе происходит разрыв цепи ДНК вблизи повреждения под действием эндонуклеазы, узнающей нарушения структуры ДНК. Такая УФ-специфическая эндонуклеаза была выделена из Micrococcus luteus и Е. coli. За разрывом цепи ДНК следует удаление пиримидиновых димеров, осуществляемое экзонуклеазой. Удаление димеров сопровождается дополнительной деградацией ДНК с образованием брешей, размеры которых варьируют от 20 до 400 нуклеотидов. Затем бреши заполняются с помощью ДНК-полимеразы, использующей в качестве матрицы интактную комплементарную цепь ДНК. Заключительный шаг в этой последовательности событии состоит в восстановлении целостности полинуклеотидной цепи в результате сшивания разрыва лигазой.
Второй тип темновой репарации — пострепликативная рекомбинационная репарация — был впервые описан Говард-Флендерсом. Как указывает само название, эта репаративная система устраняет повреждения в ДНК после того, как произошла ее репликация.
Клеточная система репликации способна «обходить» некоторые из димеров в матричной цепи ДНК, оставляя в растущей цепи бреши, расположенные напротив каждого из них. Число брешей, возникающих таким путем, примерно соответствует числу димеров в ДНК. В результате процесса, сходного с рекомбинацией и включающего обмен между сестринскими нитями, образуется ДНК с двумя интактными цепями. Обнаружено, что при заполнении брешей происходит обмен между облученной родительской цепью ДНК и необлученной дочерней цепью. Установлено, что для образования интактных, не содержащих димеры молекул ДНК, заполнение брешей не обязательно, вместо этого концентрация димеров может просто постепенно снижаться в ходе последовательных циклов репликации ДНК после облучения (Покровский В.И., 1999).
6.1.2 Механизмы резистентности Micrococcus radiodurans
Исключительная резистентность М. radiodurans вызывает особый интерес, исследование кривых выживания выявило очень длинное плечо, выходящее за пределы 1,5 мрад. Этот организм обладает наивысшей резистентностью к гамма-излучению по сравнению со всеми изученными до сих пор микроорганизмами. Для него характерна также необычайная резистентность к УФ-излучению, превышающая резистентность всех исследованных в этом отношении бактерий. Кривая выживания при УФ-облучении состоит из трех компонентов: очень длинного плеча, доходящего до 9000 эрг-мм-2, экспоненциальной части и выраженного «хвоста», который начинается при 25 000 эрг-мм-2 и тянется значительно дальше 50 000 эрг-мм-2. Наличие большого плеча указывает на существование исключительно эффективной клеточной системы репарации.
Имеются различные причины его резистентности к УФ-облучению. В качестве таковых рассматривались экранирование ДНК другими поглощающими соединениями; резистентность, присущая самой ДНК в силу особенностей ее структуры; высокая эффективность репаративных механизмов, а также высокая степень плоидности. Для того чтобы сделать выбор между этими возможностями, исследовались кривые выживания, образование тиминовых димеров как функция дозы УФ-излучения, нуклеотидный состав ДНК и кинетика синтеза ДНК после облучения. В ДНК М. radiodurans при УФ-облучении индуцируется приблизительно втрое меньше тиминовых димеров, чем в ДНК Е. coli. Частично эта разница в димеризации обусловлена различиями в нуклеотидном составе ДНК этих микроорганизмов: у М. radiodurans отношение G + C/A-t-T в 1,6 раза больше, чем у Е. coli (Белозерский, Спирин, 1960). Возможно, имеет значение также разница в поглощении УФ-излучения в расчете на одну клетку. Показано, что эта величина несколько меньше для М. radiodurans, чем для Е. coli. Неизвестно, полностью ли трехкратная разница в димеризации тимина обусловлена различиями в нуклеотидном составе ДНК и поглощении УФ-излучения в расчете на одну клетку. Во всяком случае сам факт уменьшения числа образующихся димеров совершенно недостаточен для объяснения более высокой радиорезистентности М. radiodurans.
При сравнении влияния УФ-облучения на последующий синтез ДНК в клетках М. radiodurans и Е. coli выяснилось, что одинаковая по продолжительности задержка репликации ДНК возникает у них тогда, когда клетки М. radiodurans облучают в дозе, величина которой в 20 раз превышает соответствующую величину для Е. coli. Это различие обусловлено очень высокой эффективностью удаления димеров тимина у М. radiodurans. Димеры тимина вырезаются из клеточной ДНК до возобновления ее репликации. Механизм вырезания пиримидиновых димеров у этой бактерии настолько эффективен, что гибель клеток происходит по каким-то другим причинам, к числу которых может относиться, например, модификация дезоксицитидина и белков.
Повышенная резистентность М. radiodurans к летальному действию облучения явно сопровождается его повышенной резистентностью к индуцированному мутагенезу. Для некоторых радиационно-чувствительных мутантов Е. coll было показано, что характерная для них высокая мутабильность сопутствует их повышенной чувствительности к летальному действию облучения. Ни штамм дикого типа, ни температурно-чувствительный мутант не дают мутаций при УФ-облучении в такой высокой дозе, как 15 000 эрг. Напротив, у Е. coli индуцирование мутаций наблюдается при облучении в дозе 100 эрг.
При облучении в дозе 110 крад, вызывающей значительные физико-химические изменения в ДНК Е. coli В/г, выживание М. radiodurans составляет 100%. Процесс репарации радиационных повреждений у М. radiodurans исключительно точен и не допускает ошибок; этот факт заслуживает особого внимания и может иметь значение для эволюции организмов. Хотя большинство микроорганизмов не способно репарировать двухцепочные разрывы ДНК, М. radiodurans обладает способностью к репарации таких разрывов, индуцируемых гамма-лучами, чем и объясняется его высокая резистентность к ионизирующему излучению. Ионизирующее излучение индуцирует у М. radiodurans освобождение связанной с клеточной поверхностью экзонуклеазы. Это явление можно рассматривать как модель освобождения связанных с мембранами репаративных ферментов после облучения. Более подробное исследование энзимологии репарации ДНК у М. radiodurans было бы полезным для углубления понимания молекулярных основ радиорезистентности (Кашнер Д., 1981).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
