10027 (600331), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Для того чтобы добиться высокого качества изображения, препятствуют образованию больших кристаллов льда. Это возможно при ускоренном замораживании образца. Один из методов такого быстрого замораживания состоит в охлаждении до - 269°С жидким гелием. Особенно впечатляющие результаты получают после глубокого травления быстро замороженных клеток. Этот метод позволяет выявлять структуры внутреннего содержимого клеток, демонстрируя их трехмерную организацию с исключительной четкостью.

Поскольку в этом случае в микроскопе под вакуумом наблюдают не образцы, а реплики, полученные после оттенения металлом, методы замораживание-скалывание и замораживание-травление можно использовать для изучения замороженных нефиксированных клеток и исключить риск проявления артефактов, вызванных фиксацией.

Используя для контрастирования оттенение солями тяжелых металлов, можно наблюдать в электронный микроскоп изолированные макромолекулы, например, ДНК или большие белки, а после негативного контрастирования разрешению поддаются даже мельчайшие детали. При приготовлении образцов для негативного контрастирования исследуемые молекулы наносят на тонкую пленку углерода (практически прозрачную для электронов), затем ее смачивают концентрированным раствором солей тяжелых металлов, например, уранилацетата. После высушивания образца тонкая пленка солей тяжелых металлов равномерно покрывает углеродную подложку, за исключением участков, занятых адсорбированными макромолекулами. Вещество макромолекул более проницаемо для электронов по сравнению с прилежащими участками, покрытыми солями тяжелых металлов; за счет этого возникает обращенное или негативное изображение молекулы.

В настоящее время можно наблюдать с высоким разрешением даже внутренние детали трехмерных структур, таких, как вирусы. Для этого используют метод криоэлектронной микроскопии, где очень тонкий (примерно 100 нм), быстро замороженный слой влажного образца помещают на микроскопическую решетку. С помощью специального приспособления гидратированный образец удерживают при - 160^сС в вакууме микроскопа. Таким способом можно наблюдать материал практически непосредственно: без фиксации, окраски и сушки.

1.3 Рентгеноскопия

Рентгеновские лучи, подобно свету, являются одной из форм электромагнитного излучения, но вследствие того, что длина волны рентгеновских лучей значительно короче, их применение позволяет разрешить значительно более мелкие детали. В отличие от видимого света или потока электронов, рентгеновские лучи нельзя сфокусировать и после их прохождения через образец получить обычное изображение. Однако структуру образца можно выявить, используя метод дифракции рентгеновских лучей.

Рассеянное излучение можно рассматривать как набор перекрывающихся волн, каждая из которых отражается разными участками объекта. Если волны перекрываются, они подвергаются интерференции и возникает распределение излучения, известное как дифракционная картина. Дифракционная картина может быть зарегистрирована на фотопластинке, помещенной на некотором расстоянии от предмета, или представлена с помощью количества рассеянного излучения, отраженного объектом в разных направлениях. Форма дифракционной картины определяется структурой объекта. С другой стороны, исходя из полного описания дифракционной картины, можно теоретически рассчитать структуру данного объекта

Полная дифракционная картина кристаллической решетки будет состоять из множества ярких пятен различной интенсивности. Относительная интенсивность различных пятен в дифракционной картине зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение. В действительности интенсивность данного пятна пропорциональна интенсивности излучения, которое будет отражаться в данном направлении от характерного одиночного объекта.

Таким образом, положение пятен в дифракционной картине зависит от расположения объекта в системе, а их интенсивность дает информацию о внутренней структуре типичного объекта. Более того, такая информация является точной и достаточной, поскольку она была получена путем объединения вкладов множества равноценных источников. Пользуясь довольно полным описанием дифракционной картины, можно зачастую вычислить структуру отдельных объектов, образующих кристаллическую решетку.

Длина волны рентгеновских лучей около 0.1 нм (что соответствует диаметру атома водорода), и поэтому данный тип излучения идеально подходит для анализа расположения индивидуальных атомов в молекулах. Такую задачу нельзя решить даже на самых современных электронных микроскопах. Существенным преимуществом рентгеновских лучей является высокая (выше, чем у электронов) проникающая способность. Это делает пригодными для анализа более толстые образцы. И, наконец, поскольку в данном случае использование вакуума не предусмотрено, можно изучать толстые водосодержащие образцы. Вследствие этого исключаются артефакты, возникающие в процессе приготовления образца.

Для достижения высокого разрешения необходимо иметь кристаллы с высокой степенью упорядоченности. По мере прохождения через образец рентгеновские лучи рассеиваются электронами атомов, составляющими образец. Поэтому большие атомы с большим количеством электронов рассеивают рентгеновские лучи более эффективно, чем небольшие атомы, так что атомы С, N, О, Р регистрируются гораздо более надежно, чем атомы Н.

Расшифровка рентгенограмм, образованных крупными и неупорядоченными молекулами белков, до 1960 года была невозможна. В последние годы рентгеноструктурный анализ все более автоматизируется. Рассеянные рентгеновские лучи измеряются электронными детекторами, а компьютеры выполняют необходимые вычисления. В настоящее время наиболее длительным этапом в подобном исследовании является этап получения подходящих кристаллов исследуемых макромолекул; зачастую на подбор оптимальных условий кристаллизации уходят годы. Имея хорошие кристаллы, можно рассчитать структуру белка с разрешением 0,3 нм и выявить не только основные закономерности расположения полипептидной цепи, но и некоторые более мелкие детали. Именно таким образом к настоящему времени были установлены структуры более сотни белков и нескольких малых молекул РНК и ДНК.

Раздел II Методы изучения химической среды живых клеток

Классические методы микроскопии позволяют судить о клеточной архитектуре, но не дают подробной информации о клеточной химии. Поддержание жизни возможно только при быстрой и точной регуляции концентрации таких важнейших метаболитов, как АТФ, глюкоза и неорганические ионы; содержание этих веществ в различных участках клеток и тканей может существенно варьировать. Более того, поскольку низкомолекулярные вещества, такие, как клеточный АТФ, кальций и водород могут выполнять функцию внутриклеточных "мессенджеров", очень важно уметь прослеживать изменение их концентрации в ответ на внутриклеточные сигналы. Обсудим некоторые методы, которые позволяют определять химические условия в клетках в процессе их жизнедеятельности.

2.1 Использование ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для определения химических условий в живых клетках

Ядра многих атомов характеризуются магнитным моментом: следовательно, они обладают внутренним магнетизмом. Магнитные характеристики этих атомов подвержены влиянию со стороны окружающих атомов. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), являющийся безвредным для живых клеток, позволяет определить химическую природу вещества. Если ядра атомов, обладающие магнитным моментом, поместить в магнитное поле, они принимают одну из возможных ориентации. Каждая из ориентации характеризуется энергией, определяемой силой поля и химическим окружением. При облучении радиоволнами набора атомов в идентичном химическом окружении, энергия этих волн будет в значительной степени абсорбироваться, если волны обладают строго определенной частотой, соответствующей разности энергетических состояний двух возможных ориентации ядер в магнитном поле. Это так называемая резонансная частота. Образец ткани содержит атомы в различных молекулах, в различном окружении, поэтому он будет поглощать энергию на различных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для данного образца составит его спектр ЯМР. Такой спектр отражает структуру и относительное содержание каждого типа молекул, содержащих магнитные ядра.

Лишь некоторые атомы имеют изотопы, создающие удовлетворительный сигнал ЯМР. Для изучения макромолекул, содержащихся внутри живой клетки, обычно используют широко распространенные изотопы ¹Н, ¹³Na, ^3lP, ³⁹K и редкие изотопы ^l3C и ^l5N. Ввиду важной роли соединений фосфора, которую они играют в метаболизме, эффективным оказывается определение ЯМР ³¹Р. Этот изотоп в норме присутствует в фосфорсодержащих веществах клеток. Сигналы, создаваемые им, можно использовать для слежения за изменением внутриклеточной концентрации в процессе мышечного сокращения таких соединений, как АТР и неорганический фосфат.

Редкие изотопы ¹³С и ^I5N в норме не содержатся в клетках в достаточных количествах, однако их можно вводить в специфические макромолекулы, имеющие биологическое значение. С помощью ЯМР удается следить впоследствии за их химической трансформацией. Если, например, выращивать клетки на среде с глюкозой ¹³С, то, измеряя в течение некоторого времени спектр ЯМР образца, можно определять скорость многих реакций, в которых участвует глюкоза.

Основным ограничением метода ЯМР является его низкая чувствительность. Например, для определения содержания какого-либо соединения с использованием современных модификаций метода ³¹Р-ЯМР, в грамме живой ткани должно содержаться не менее 0,2 мМ исследуемого соединения. Однако многие метаболиты присутствуют в живых тканях в более низких концентрациях. Более того, поскольку для снятия одного спектра ЯМР требуется, как правило, несколько минут, можно не уловить быстрые изменения цитохимических характеристик. С другой стороны, значительное преимущество ЯМР состоит в его безвредности для живых клеток, и это обстоятельство делает данный метод весьма перспективным для клеточной биологии.

2.2 Использование внутриклеточных электродов

Для изучения отдельных клеток необходимо использовать методы более чувствительные, чем ЯМР. Один из них основан на подходе, разработанном электрофизиологами для изучения разности потенциалов и тока на плазматической мембране. С этой целью готовят внутриклеточные микроэлектроды. Они состоят из тонких стеклянных трубок, диаметр конца которых измеряется долями микрона; такие трубочки заполняют электропроводным раствором (обычно это раствор соли КС1 в воде). Кончик микроэлектрода вводят в цитоплазму через плазматическую мембрану, которая смыкается вокруг капилляра, плотно прилегая к стеклу, так что клетка остается относительно неповрежденной.

В исследовании клеточного содержимого микроэлектроды используют двояко: с их помощью можно измерять внутриклеточную концентрацию обычных ионов, таких, как ионы Н⁺ ,Na⁺, K⁺, Cl^-, Ca²⁺ и Mg²⁺. Они могут быть использованы и для инъекции молекул в клетки.

Микроэлектродную технику используют для изучения транспорта ионов через специализированные белковые каналы (именуемые также ионными каналами), содержащиеся в небольших участках плазматической мембраны. В этом случае необходим стеклянный микроэлектрод с несколько более толстым кончиком. Его не вводят в плазматическую мембрану, а плотно и мягко прижимают к ней. Это позволяет регистрировать электрические характеристики небольшого участка мембраны, прилегающего к кончику микроэлектрода, который прикасается к клетке или находится на небольшом расстоянии от нее. Данный метод известен как "пэтч-регистрация" (регистрация в данном участке). Его применение произвело настоящую революцию в исследовании ионных каналов. Это едиственный метод клеточной биологии, который дает возможность изучать функцию одиночной белковой молекулы в реальном времени.

2.3 Использование светоизлучающих индикаторов

Электроды, чувствительные к определенным ионам, позволяют измерять их концентрацию только в одной точке на клеточной поверхности. Если же ионы представлены в клетках в низкой концентрации, показания таких электродов зачастую оказываются ошибочными. Поэтому в таких случаях для регистрации используют внутриклеточные индикаторы, излучающие свет. Такими являются люминесцентные и флуоресцентные вещества, например, белок акварин или синтетические. Этим способом измеряют концентрацию ионов кальция и водородных ионов.

Для введения в клетки молекул, не проникающих через мембрану (это могут быть светоизлучающие индикаторы, клеточные белки, связанные с флуоресцентной меткой) используют микроинъекции молекул в клетки с помощью стеклянной микропипетки. Используя соответствующий микроскоп, исследователь получает возможность следить за поведением такого белка в процессе роста и деления клеток.

Микроинъекции - весьма эффективный и достаточно широко используемый метод, однако важно помнить, что в данном случае процедуре микроинъекции подвергается каждая клетка отдельно, поэтому количество клеток ограничено. Для повышения проницаемости клеточных мембран используют мощный электрический разряд или химическое воздействие, например, раствором детергента низкой концентрации. Электрический разряд создает в плазматической мембране большие поры без повреждения внутриклеточных мембран. Эти поры остаются открытыми в течение нескольких минут и даже часов в зависимости от типа клеток и интенсивности электрического воздействия. Через эти поры макромолекулы могут быстро входить в цитозоль или покидать его. При ограниченном воздействии мембрана многих клеток восстанавливается и клетки выживают. Третий метод введения в клетки крупных молекул состоит в слиянии частиц, окруженных мембраной и содержащих необходимые молекулы, с плазматической мембраной клетки.

Раздел III Методы культивирования клеток и определения их состава

Структуру органелл и крупные молекулы можно изучать под микроскопом; для локализации специфических молекул в клетке разработаны эффективные методы окрашивания. Однако чтобы разобраться в молекулярных основах клеточной организации, необходим детальный биохимический анализ. К сожалению, биохимические методы предполагают использование значительного количества клеток и в процессе исследования клетки разрушаются. Если в качестве образца для биохимического анализа использовать кусочек ткани, то после разрушения будет получена смесь фрагментов различных клеток. И если ткань образована клетками разного типа, что скорее является правилом, чем исключением, то разобраться в этой смеси будет просто невозможно. Для того, чтобы извлечь максимум информации о всех клетках, составляющих ткани, разработаны методы разделения тканей на клетки и методы выделения отдельных типов клеток. Полученную относительно гомогенную популяцию клеток можно подвергать анализу непосредственно, либо предварительно размножив их путем культивирования.

3.1 Методы культивирования клеток

Характеристики

Список файлов курсовой работы