10451 (567395), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

2.4 Выделение ДНК из растительных клеток

Усилия многих исследователей направлены'сейчас на разработку методов получения интактных хромосомных ДНК из солидных тканей. Предварительные эксперименты с плоскими червями, Caenorhabditis elegans, личинками Drosophila и с Chlamy-domotias продемонстрировали возможность использования различных приемов. Для небольших многоклеточных организмов могут пригодиться методы, применяемые для одноклеточных. Для предотвращения выхода подвижных клеток за пределы вставок полезна обработка раствором 0,2 мМ азида натрия. ДНК с большим молекулярным весом удается получить при обработке коллагеназами, гомогенизировании, трипсинизации или просто разрезании материала, помещенного в раствор ESP. Можно вначале выделить из клеток ядра, а затем из них приготовить вставки с образцами.

3. Работа с агарозными блок-вставками, содержащими образцы ДНК

Для многих целей удобнее и проще иметь дело с ДНК, заключенными в агарозный гель, чем находящимися в растворе. Низкомолекулярные компоненты свободно диффундируют через агарозу при мягком перемешивании. Мы работали с 100 мкл-агарозными блок-вставками просто как с жидкими образцами объемом 100 мкл.

Возможность обрабатывать ДНК ферментами непосредственно в агарозе зависит от типа агарозы. По крайней мере, половина партий агарозы содержит примеси, которые не позволяют ферментам эффективно работать. Компания FMC выпускает агарозу с низкой температурой плавления, специально проверенную на пригодность к рестрикционной обработке заключенных в нее молекул ДНК.

3.1 Ферментативная обработка

Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.

Характеристики

Список файлов ответов (шпаргалок)