Диссертация (1174236), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Концентрациюиммуноглобулинов в пробе вычисляли относительно контрольной сыворотки,38содержащейсявиммуноглобулинов.наборереагентов,сизвестнымиРасчетколичестваиммуноглобулиновконцентрациямиосуществлялис помощью построенной стандартной кривой.Концентрацию ЦИК в сыворотке крови определяли путем осажденияполиэтиленгликолем (ПЭГ, молекулярная масса 6000) (Гриневич Ю.А., АлферовА.Н., 1981) по следующей методике:смешивали 0,2 мл сыворотки с 0,4 мл боратного буферного раствора, затемразливали полученную смесь по схеме:СмесьБоратный буфер3,5% раствора ПЭГОпыт0,2 мл-1,8 млКонтроль0,2 мл1,8 мл-Инкубировали 2 часа при комнатной температуре, после чего измерялиоптическую плотность образцов с помощью фотоколориметра (при длине волны450 нм, толщине кюветы 1 см).
Разность между показателями оптическойплотности умножали на 1000, получая таким образом концентрацию ЦИКв сыворотке крови, выраженную в у.е. (условных единицах).Определениефагоцитарнойактивностинейтрофилов.Выделенныелейкоциты инкубировали в течение 30 мин при 37°С с частицами латексастандартного диаметра 1,35 мкм («Иммуноскрин», Москва). Приготовленный напредметном стекле мазок окрашивали азур-эозином и подсчитывали числонейтрофилов, поглотивших частицы латекса, и количество захваченных частиц.Процент фагоцитирующих клеток обозначали как фагоцитарный индекс.
Числочастиц,захваченноевсреднемоднимфагоцитирующимнейтрофилом,соответствовало фагоцитарному числу (Хаитов Р.М. и др., 1995).Иммуногенетический анализ. Лимфоциты выделяли из свежей крови(в качестве антикоагулянта использовали гепарин), центрифугируя 20 мин при2000 оборотах в минуту на градиенте фиколл-верографина плотностью 1,077 г/мл.ТипированиеHLA-антигеновIклассапроводиливстандартноммикролимфоцитотоксическом тесте (Зарецкая Ю.М., 1983), используя HLA-39сыворотки ЗАО «Межрегиональный центр иммуногенетики и гистотипирующихреагентов «Гисанс» (С.-Петербург).Антисыворотки к 8 антигенам HLA-A локуса (А1, А2, А3, А9, А10, А11,А19, А28) и 18 антигенам HLA-В локуса (В5, В7, В8, В12, В13, В14, В15, В16,В17, В18, В21, В22, В27, В35, В40, В41, В42, В53) заранее вносилив подготовленный HLA-А, -В микропланшет. В каждую лунку такого планшетавносили 1 мкл суспензии свежевыделенных лимфоцитов (2000-3000 клеток на1 мкл), инкубировали 30 минут при комнатной температуре и добавлялистандартный кроличий комплемент в количестве 5 мкл.
После инкубациимикропланшета в течение 1 часа при комнатной температуре в каждую лункудобавляли 5% раствор эозина (3 мкл) и через 5 минут реакцию фиксировали 17%раствором формалина (8 мкл). Результаты учитывали через час с помощьюинвертированногомикроскопа.Реакциюоценивалипосоотношениюпрокрашенных (погибших) и непогибших клеток в поле зрения микроскопа:- отрицательная – количество погибших клеток 0-20%;- слабоположительная – при количестве 21-50%;- положительная – при количестве 51-80 %;- резкоположительная – при количестве 81-100%.HLA-типированиеаллелейIIклассаосуществлялиметодомПЦР,разработанной в «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (Трофимов Д.Ю.,1996).
Проводили типирование локусов HLA-DRB1 (14 аллелей), HLA-DQA1(8 аллелей) и HLA-DQB1 (11 аллелей).ДНК мононуклеаров, выделенных из исследуемых образцов крови, взятой сЭДТА в качестве антикоагулянта, использовали для амплификации, которуюпроводили в два этапа (для локуса DRB1) и три этапа (для локусов DQА1и DQВ1).Типирование локуса DRB1 проводили в два этапа. На первом этапеамплификацию ДНК проводили в двух пробирках:40- в первой пробирке находились праймеры для аллелей – *01, *02 (*15 и *16), *04,*07, *09, *10;- во второй пробирке – праймеры для аллелей из группы *03 (*17 и *18), *05 (*11и *12), *06 (*13 и*14), *08.Для амплификации использовали следующий температурно-временнойрежим (термоциклер – «МС-2» производства «ДНК-технология», режимактивного, быстрого (“fast”) регулирования): один цикл – при 94°С в течение1 мин.; семь циклов – повторяя при 94°С в течение 20 сек.
и 67°С в течение2 сек.; двадцать восемь циклов – повторяя при 93°С в течение 2 сек. и 65°Св течение 4 сек.Продукты амплификации, разведенные в 10 раз, использовали наследующем этапе для определения аллелей гена DRB1 – *01, *15 (*02), *16 (*02),*17 (*03), *18 (*03), *04, *11 (*05), *12 (*05), *13 (*06), *14 (*06), *07, *08, *09,*10. Амплификация проводилась при следующем режиме (термоциклер - «МС-2»«ДНК-технология», активное, точное (“precise”) регулирование): 15 циклов –повторяя при 93°С в течение 5 сек. и 64°С в течение 10 сек.Генотипирование локуса DQА1 проводили в три этапа:- первый этап – с использованием праймеров, амплифицирующих все DQА1аллели;- второй этап – использовали праймеры для аллелей *01, *0201, *0301, *04/06,*0501;- третий этап проводили, если были выявлены аллели *01 и/или *04/06, здесьопределяли аллели *0101, *0102, *0103, *0401, *0601.Для первого этапа использовали следующую программу (термоциклер«МС-2» производства «ДНК-технология», режим активного, быстрого (“fast”)регулирования): один цикл – при 94°С в течение 1 мин.; семь циклов – повторяяпри 94°С в течение 20 сек.
и 58°С в течение 5 сек.; 28 циклов – повторяя при 92°Св течение 5 сек. и 56°С в течение 10 сек.Полученные продукты первого этапа, разведенные в 10 раз, использовали вдальнейшем по следующей программе (термоциклер «МС-2»производства «ДНК-41технология», режим активного, точного (“precise”) регулирования: двенадцатьциклов – повторяя при 93°С в течение 5 сек.
и 62°С в течение 10 сек.Для типирования DQB1-локуса использовали три этапа:- первый этап – с использованием праймеров, амплифицирующими все DQB1аллели при следующем (термоциклер «МС-2» производства «ДНК-технология»,режим активного, быстрого (“fast”) регулирования) температурном режиме: одинцикл – при 94°С в течение 1 мин.; семь циклов – повторяя при 94°С в течение20 сек. и 67°С в течение 5 сек.; двадцать восемь циклов – повторяя при 93°Св течение 5 сек. и 65°С в течение 10 сек.Разведенные в 10 раз продукты первого этапа использовали далее.- на втором и третьем этапах добавляли праймеры для HLA-аллелей: *0201,*0301, *0302, *0303, *0304, *0305, *0401/0402, *0501, *0502/0504, *0503, *0601,*0602-08 при следующем режиме (термоциклер «МС-2» производства «ДНКтехнология», активное, точное (“precise”) регулирование): двенадцать циклов –повторяя при 93°С в течение 1 сек.
и 67°С в течение 2 сек.Продуктыамплификацииидентифицироваливпроходящемультрафиолетовом свете (254 нм) после проведенного в течение 15 минут принапряжении 220 В электрофореза в окрашенном бромистым этидием 3,2%агарозном геле.2.3. Методы статистической обработки результатовСтатистическая обработка полученных данных производилась с помощьюпакета прикладных программ «Statistica v.10.0». Из характеристик описательнойстатистики для представления полученных данных использовали M – среднееарифметическое, SD – среднее квадратичное отклонение.
Достоверность различиймежду изучаемыми выборками по анализируемому показателю оценивали попараметрическому t-критерию Стьюдента (р). Для оценки достоверности связимежду двумя рядами наблюдений применяли ранговый коэффициент корреляцииСпирмена (rs). Статистически значимыми считались различия данных и42корреляция между ними при prs < 0,05.Приобработкеданныхиммуногенетическогоанализаиспользовалиспециальные математические методы (Зарецкая Ю.М., 1983; Зарецкая Ю.М.,Абрамов В.Ю., 1986). Частоту антигена f рассчитывали как процентное (долевое)соотношение индивидуумов (n), несущих антиген к общему числу обследованных(N) по формуле: f = n/N. Частоту гена р определяли по формуле: р = 1-√1-f.Частоту аллелей для локусов DRB1, DQA1, DQB1 рассчитывали по формуле:f=n/2N, где n – частота встречаемости аллеля (у гомозигот n учитывали дважды).Величину неравновесного сцепления (гаметной ассоциации) вычисляли поформуле: D = √d/n - √b + d /n x c+ d/n; где n = a+b+c+d; a,b,c,d - значения в таблице2х2; a - присутствуют оба гена, b и c - присутствует один ген; d - отсутствуют обагена (Mattiuz P.
et al., 1970). Частоту гаплотипа двух генов i и j определяли поформуле: H = Dij + pi pj , где pi pj - генные частоты HLA антигенов. Достоверностьвеличины D определяли по точному двустороннему тесту Фишера длячетырехпольных таблиц (Браунли К.А., 1977).Для определения степени ассоциации ХОБЛ с HLA-специфичностямииспользовали критерий относительного риска – RR (relative risk) (ПевницкийЛ.А., 1988; Яздовский В.В., 1994). Показатель RR рассчитывали по формулам J.Haldane и B. Woolf (Svejgaard A. еt al., 1974; Певницкий Л.А., 1988).Относительный риск (ОР) означает, во сколько раз чаще встречается заболеваниепри наличии в генотипе индивидуумов какого-либо варианта HLA генов посравнению с частотой заболевания у индивидуумов без этого HLA варианта.Значения ОР большие, чем 1, свидетельствуют о положительной ассоциации HLAспецифичности с развитием рассматриваемого заболевания.
Значения ОР,меньшие, чем 1, указывают на ассоциацию вариантов HLA генов с устойчивостьюк развитию заболевания. Значения ОР, близкие к 1, свидетельствует об отсутствииассоциаций. Достоверность ассоциаций (р) оценивали по критерию χ2 дляальтернативных признаков с поправкой Йетса на непрерывность выборки(Svejgaard A. еt al., 1974) и по критерию Фишера. Корригированное значение р (рс)43вычисляли умножением показателя р на число исследованных HLA-аллелей (n)(Певницкий Л.А., 1988).Иммунологические показатели у больных ХОБЛ и резистентных к развитиюХОБЛработниковкремнийорганическогопроизводствасравнивалисреференсными значениями, полученными при обследовании здоровых жителейг.
Новочебоксарска, принадлежащих к этнической группе чувашей и не занятых вкремнийорганическом производстве (n=175).44РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯИММУННОЙ СИСТЕМЫ У РАБОТНИКОВКРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА3.1. Общая клиническая характеристика групп обследованияПод нашим наблюдением находились работники, занятые в производствекремнийорганических соединений в ПАО «Химпром» (г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
