Диссертация (1149183), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Отсутствие локальных минимумов в профиле свободной7энергии свидетельствует об отсутствии притяжения между ДНК и соответствующимлипидным бислоем.2. В присутствии ионов кальция наблюдается электростатического притяжениемежду молекулой ДНК и липидным бислоем. Адсорбированные на поверхностьбислоя ионы кальция приводят к появлению минимума в профиле свободнойэнергии.3.
Впервые установлен молекулярный механизм образования ДНК-липидногокомплексавприсутствииионовкальция.Адсорбцияионовкальциянацвиттерионную липидную мембрану приводит к адсорбции ДНК и образованиюконтактов между фосфатными группами ДНК и холиновыми группами липидов иформированию кальциевых мостиков между фосфатными группами липидов и ДНК.Данные кальциевые мостики являются доминирующим фактором в стабилизациикомплекса ДНК-мембрана, так как их время жизни почти на 2 порядка больше, чемсоответствующие времена для контактов между холиновыми группами липидов иДНК.Личный вклад автора заключался в адаптации моделей ДНК и липидного бислоядля программного пакета Gromacs, построении систем моделирования, проведениибольшинства компьютерных экспериментов методом молекулярной динамики,анализе полученных результатов и непосредственном участии в написании статейпод руководством научного руководителя.Апробация работы и публикации: результаты данной работы были опубликованы вдвух статьях в международных рецензируемых журналах и в виде тезисов докладовна международных конференциях.По материалам диссертации были сделаны доклады на следующих конференциях:1.
8th international symposium “Molecular order and mobility in polymer systems”,Санкт-Петербург, 201482. IX International conference of young scientists on chemistry „Mendeleev-2015”,Санкт-Петербург, 20153. 11-th International Conference on Diffusion in Solids and Liquids-DSL 2015,Мюнхен, Германия, 20154. 3rd European Joint Theoretical/Experimental Meeting on Membranes, Стокгольм,Швеция, 20155. 11th International Saint-Petersburg Conference of Young Scientists “Modern problemsof polymer science”, Санкт-Петербург, 20156. International Student Conference “Science and Progress”, Санкт-Петербург, 2015(отмечено дипломом за лучший устный доклад)Структура работыДиссертационная работа изложена на 84 страницах и состоит из введения, четырёхглав, заключения и списка литературы, который включает 124 наименования.
Диссертация содержит 21 Рисунок и 2 таблицы. Работа построена следующим образом:В первой главе представлен обзор литературы. В этой главе представлена информация о невирусных методах доставки ДНК в клетку, в частности, генных векторах наоснове катионных липосом. Приведены результаты экспериментальных исследований цвиттерионных липидов и молекул ДНК, их взаимодействия с ионами. Крометого, описано современное состояние методов компьютерного моделирования.Вторая глава посвящена описанию создания систем и условий моделирования; приведены сведения об используемых методах и моделях, а также подходах для анализаполученных траекторий моделирования.В третьей главе приведены результаты исследования системы “ДНК-липидныйбислой” в водном растворе.Четвертая глава посвящена исследованию механизма образования ДНК-липидногокомплекса в присутствии ионов кальция.
Приведены результаты моделирования си-9стемы ДНК-липидный бислой с ионами кальция, добавленными в водную фазу одновременно с ДНК. Проведен анализ структурных и динамических характеристиксистемы ДНК-липидный бислой с заранее адсорбированными ионами кальция намембрану. Сделаны выводы о механизме адсорбции ДНК на липидный бислой иконтактах, отвечающих за стабильность комплекса.В заключении сформулированы выводы по диссертационной работе.10ГЛАВА 1. Литературный обзор1.1.Векторы доставки генетического материалаВ настоящее время генные векторы служат эффективным средством лечениягенетических заболеваний.
Вектор осуществляет адресную доставку генного материала в пораженные клетки-мишени, оказывая фармакологическое действие. Векторыдля генной терапии можно разделить на две большие группы: вирусные и невирусные (синтетические). На сегодняшний день векторы на основе вирусов являютсянаиболее распространенными [18] и более эффективными средствами доставки ДНКв клетки, однако они имеют ряд недостатков: размер ДНК, который может бытьвстроен в вирус, ограничен; иммунный ответ организма предотвращает повторноевведение вектора; крупномасштабное производство вирусных векторов испытываеттрудности, и главное, его применение является небезопасным из-за возможностивстраивания вирусной ДНК в геном клетки.
В отличие от вирусных векторов доставки, которые обладают свойствами прохождения клеточного барьера, эффективностьтрансфекции невирусного вектора снижена из-за сложности преодоления мембраныклетки и внутриклеточных барьеров. Несмотря на это, биосовместимость, и, следовательно, безопасность, а также возможность производства в промышленных масштабах делают невирусные векторы доставки перспективным кандидатом на рольсредства доставки ДНК в клетки. Одним из самых простых и распространённых [18]невирусных способов доставки ДНК в клетку является прямое введение свободнойДНК внутрь клетки при помощи различных методов, способных повысить проницаемость мембраны клетки. К таким методам относятся электропорация [19], сонопорация [20], технология генной пушки [21] и прямая микроинъекция в клетки-мишени[22]. Клинические исследования показали низкую эффективность данных методовиз-за быстрого расщепления свободной ДНК нуклеазой, низкую поглощаемость11клеткой из-за массивности и отрицательного заряда макромолекулы (каждое основание нуклеотида несет заряд -1), а также недоступность для некоторых проблемныхучастков организма.Таким образом, исследователи пришли к выводу, что для того чтобы генныйвектор был эффективен, массивная молекула ДНК должна быть компактизована взащитную оболочку, а получившийся комплекс эффективно взаимодействовал с клеточной мембраной, что является одним из необходимых условий для осуществлениятрансмембранного переноса.
Молекула ДНК является отрицательно заряженной молекулой, следовательно, компактизация ДНК может быть достигнута электростатическими взаимодействиями с положительно заряженными веществами. Многочисленные исследования показывают, что нуклеиновые кислоты образуют комплекс скатионными полимерами и катионными поверхностно-активными веществами. Получившийся комплекс защищает нуклеиновую кислоту от расщепления нуклеазой. Ккомплексу ДНК с катионными веществами может быть прикреплен лиганд для осуществления направленной доставки генного материала в клетку.
Известно, что поглощение клеткой ненаправленных векторов зависит от типа клетки и размера комплекса. Исследования in vitro показали, что оптимальный диаметр молекулы дляпрохождения комплекса через клеточную мембрану лежит в пределах 70-90 нм дляненаправленных векторов [23, 24] и 50-60 нм для векторов с прикрепленными лигандами (ацилогликопротеин [25], трансферин [26]).
Исследования также показывают,что размер получившегося комплекса также значительно зависит от типа катионноговещества. Например, катионный олигомер цистеин-спермин-цистеин способен обратимо сворачивать молекулу ДНК таким образом, что размер получившегося комплекса пропорционален кубическому корню из длины ДНК [27]. В то же время комплексс катионными полимерами (полиплекс [28]), которые способны сильно притягиватьнесколько молекул ДНК, имеет размер больший, чем ДНК. На сегодняшний день су-12ществует огромное количество работ по исследованию свойств полиплекса, как одного из самых эффективных средств доставки ДНК в клетки. Полиплекс образуетсяпутем самосборки катионных полимеров и ДНК, его свойства и эффективностьтрансфекции зависят от таких параметров как наличие или отсутствие гидроксильных групп и молекулярного веса полимера [29].
Так, например, диаметр комплекса сполилизином с молекулярной массой от 4 до 224 кДа варьируется от 20-30 нм до 100300 нм, соответственно [30]. Наряду с этим имеются исследования, которые показали, что форма полиплекса не зависит от типа катионного полимера. Результаты работы [29] показали, что комплексы ДНК с полилизином, полиэтиламином и различными дендримерами имели похожую тороидальную форму.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
