Диссертация (1145906), страница 11
Текст из файла (страница 11)
После электрофореза гель промывали в воде и кипятили несколько минут врастворе Кумасси. Затем кипятили в воде, чтобы убрать излишки красителя.5.5.5. Полуденатурирующий электрофорез белков в агарозном геле(SDD-AGE)ДляизучениясвойствагрегатовSup35pиспользовалиметодикуполуденатурирующего электрофореза в агарозном геле (SDD-AGE) (Kryndushkinet al., 2003; Halfmann et al., 2009). Дрожжевые культуры наращивали дооптической плотности при длине волны 600 нм (OD 600) 0,8-1,2. Клетки разрушалина гомогенизаторе FastPrep24 (MP Biomedicals) за счет перетирания стекляннымишариками в лизирующем буфере (100 мM (pH=7,5) Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 2 мМФМСФ (фенилметансульфофторид), 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2 % коктейльингибиторов протеаз (Sigma)).
Затем образцы центрифугировали (10 минут, 800 g,4оС), чтобы осадить шарики и остатки клеток, отбирали верхнюю фракцию.Количество тотального белка в полученных лизатах определяли методомБредфорд (Bradford, 1976). Концентрацию белка в пробах выравнивали спомощью добавления лизирующего буфера.Для сравнения размеров агрегатов Sup35p к клеточным лизатам добавлялибуфер для нанесения, полученные пробы инкубировали при 25оС в течение555 минут. В экспериментах по оценке термостабильности агрегатов Sup35p пробыинкубировали при различных температурах от 25оС до 100оС (Alexandrov et al.,2012). Электрофорез проводили в 1,5 % агарозном геле на основе буфера TAE(Sambrook et al., 1989), напряжение электрического поля рассчитывали как 3 Вна 1 см геля (Halfmann et al., 2009).
Белки из геля элюировали на мембрану спомощью капиллярного переноса (Halfmann et al., 2009).5.5.6. Вестерн-блот гибридизацияВестерн-блот гибридизацию проводили согласно описанной методике(Towbin et al., 1979). Для идентификации Sup35p были использованыполиклональные антитела SE4290 (Chabelskaya et al., 2004), для α-тубулина(Tub1p) — моноклональные антитела («Sigma»).
Проявление комплексовантиген-антитело осуществляли с помощью фирменных наборов вторичныхантител ECL Plus Western Blotting Detection System («Amersham») и наборареагентов ECL Plus Western Blotting Reagent Pack («Amersham»). Сигналдетектировали с помощью прибора GeneGnome («Syngene»).5.5.7. СеквенированиеСеквенированиеплазмид,полученныхвходеработы,проведеноА.Э.
Машарским на базе ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточныхтехнологий» СПбГУ.5.6. Очистка белков из культур E. сoliДля индукции сверхпродукции гетерологичного белка ночную культуруBL21, трансформированного одной из плазмид серии pET21b-SUP35NM (Табл. 3),разводили в 100 раз в среде 2TYa и инкубировали при 37 оС и интенсивномперемешивании до оптической плотности при длине волны 600 нм (OD 600) 0,4-0,6.На этом этапе добавляли ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) доконечной концентрации 1 мМ и инкубировали при тех же условиях. Через 6 часовклетки осаждали при помощи центрифугирования 5000 оборотов/мин, 4 оС, 5минут (Sambrook et al., 1989).56Лизис клеток осуществляли в денатурирующих условиях (20 мМ Tris-HСl(pH 8.0), 8 М мочевина) в течение 30 минут при легком перемешивании. Остаткиклеток осаждали центрифугированием при ускорении 30000 g (Serio et al., 1999a).Надосадочную фракцию, содержащую белки Sup35NM-(His) 6, наносили наколонки с Ni-NTA Agarose («Invitrogene»).
Последующая очистка осуществляласьсогласнорекомендациямпроизводителя(«Invitrogene»).Дляувеличенияспецифичности связывания Sup35NM-(His)6 со смолой к лизатам добавлялиимидазол до концентрации 5мМ. При смыве целевого белка с колонкииспользовали имидазол в концентрации 450 мМ.
На всех упомянутых вышеэтапах (индукция, лизис, очистка) присутствие белка в пробах контролировали спомощью SDS-PAGE (Laemmli, 1970).Очищенный белок концентрировали не менее чем до 500 мкМ с помощьюпробирок Amicon 30 KDa («Millipore») согласно рекомендациям производителя.Молярную концентрацию (М) определяли по оптической плотности раствора придлине волны 280 нм (OD280), с учетом коэффициента экстинкции Sup35NMpравном 25600 (M = OD280/25600) (Gill et al., 1989; Lin et al., 2011).5.7.
Просвечивающая электронная микроскопияСтандартные медные сеточки (100 или 200 межей) покрывали формваровойпленкой (0,3 % раствор поливинилформаля в хлороформе). Затем на сеточкинаносили раствор фибрилл и инкубировали 30 секунд, жидкость убиралифильтровальной бумагой. Для того, чтобы убрать излишки фосфатного буфера напрепарат наносили воду, которую затем также убирали фильтровальной бумагой.В конце наносили 1 % уранил ацетат, инкубировали 8 минут, остатки жидкостиубирали. После препарат дополнительно промывали, погружая его в воду (Brum etal., 2010).
Анализировали препараты на электронном микроскопе JEM Jeol-2100на базе ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий»СПбГУ.575.8. Цифровая обработка изображенийДляобработкирезультатоввестерн-блотгибридизациииспользовалипрограмму ImageJ 1.47i (Wayne Rasband National Institutes of Health, USA). В этойпрограмме получали графики распределения оптической плотности сигналов наснимках. Эти данные затем анализировали с помощью функций в статистическойсреде R v. 2.4.11 (R Development Core Team.
R Foundation for Statistical Computing,Austria), разработанных в ходе работы. Суть этой обработки заключалась вопределении базовой линии фона и расчете интегрированных значенийоптических плотностей за вычетом базовой линии. С помощью программы ImageJтакже проводили измерения линейных характеристик фибрилл Sup35p.5.9. Статистическая обработкаВсю статистическую обработку, а также построение графиков, осуществлялис помощью пакета R v. 2.4.11 (R Development Core Team.
R Foundation forStatistical Computing, Austria).586. РЕЗУЛЬТАТЫ6.1. Теоретические предпосылки для создания мутантных аллелей SUP35Мутацииsup35-M1(YQ46-47KK),sup35-M2(QQ61-62KK),sup35-M3 (QQ70-71KK), sup35-M4 (QQ80-81KK) и sup35-M5 (QQ89-90KK),исследованные в данной работе, располагаются в пределах N-домена Sup35p. Этотучасток белка необходим для поддержания приона [PSI+] (Ter-Avanesyan et al.,1994). Он включает в себя область, обогащенную аспарагином и глутамином,а также серию олигопептидных повторов (OR) (Kushnirov et al., 1988). Дляуточнения границ региона OR Андрей Каява осуществил поиск повторовв пределах N-домена Sup35p с помощью нового алгоритма T-REKS (Jorda et al.,2009).
Кроме описанных ранее шести с половиной несовершенных повторов(Рис. 8, выделено красным) были идентифицированы еще два (Рис. 8). Согласноуточненным данным, регион олигопептидных повторов располагается между28-ым и 118-ым а.к.RYQGYQA-YNAQAQPAGGYYQNYQGYSGYQQGGYQQ-YN----PDAGYQQQYN----PQGGYQQ-YN----PQGGYQQQFN----PQGGRGNYKNFNYNNNLQGYQAGFQ—----OR0(28-40 а.к.)OR1(41-55 а.к.)OR2(56-64 а.к.)OR3(65-74 а.к.)OR4(75-83 а.к.)OR5(84-93 а.к.)OR6(94-108 а.к.)OR7(109-118 а.к.)PQGGYQQ-YNКонсенсусная последовательностьРисунок 8. Олигопептидные повторы (OR) N-домена Sup35p, вычисленные по алгоритмуT-REKS. Красным выделены повторы, описанные ранее (Kushnirov et al., 1988). Синим цветомобозначена консенсусная последовательность. Подчеркнуты аминокислотные остатки, которыебыли заменены на лизины.СогласнолитературнымданнымприонизованныйN-доменимеетпараллельную супер-складчатую β-структуру (Рис.
4) (Shewmaker et al., 2006;Shewmaker et al., 2011), на этом и был основан выбор положений для мутаций.Согласно положениям этой модели, заряженные аминокислотные остатки, а также59остатки пролинов должны локализоваться в «поворотах» между отдельнымиβ-листами. Учитывая это, Андрей Каява сделал предположение об ориентацииолигопептидных повторов в такой структуре (Рис. 9). Структура амилоидовстабилизируется за счет водородных связей между полярными незаряженнымиаминокислотами, которые в соседних молекулах располагают друг под другом.Замена таких остатков на заряженные будетприводитьк локальномурасталкиванию молекул белка из-за появления кулоновских взаимодействиймежду одноименными зарядами (Рис. 10).OR1OR3OR5QYSP AGQQP QGQPDAGNGYNAGYNYYNGQYY 46 Y81 Q 89QQNA70Q 47 Q 62 QQ 80 Q 90QQNNQ 61 Q 71 YQNQYQYYGFNQAYQGGNGGQNPQGGP QG 96QNYYQNNGOR4S GYQOR6SR YQD3OR0OR2Рисунок 9.
Предполагаемая структура N-домена Sup35p. На схеме обведены остаткипролинов и заряженных аминокислот. Голубым цветом выделены аминокислоты, заменыкоторых на заряженные приводят к потере приона [PSI+]. Желтым — остатки аминокислот,которые были заменены в ходе данной работы. OR0 – OR5 — олигопептидные повторыN-домена (отмечено начало соответствующего повтора). Цифрами подписаны положениянекоторых аминокислотных остатков.Ранее был обнаружен ряд мутаций, которые приводят к потере приона [PSI+](Табл. 2) (Doel et al., 1994; DePace et al., 1998; King, 2001). Большинство из нихприводит к появлению заряженных аминокислотных остатков в начале N-доменавплоть до второго олигопептидного повтора (Рис. 9, выделено голубым), чтотакже согласуется с моделью супер-складчатой β-структуры (Kajava et al., 2004).Учитывая этот факт, мы решили исследовать эффекты внесения заряженныхаминокислотных остатков, локализованных в регионе OR.60KKKKKKРисунок 10.
Предполагаемые эффекты полученных мутаций. Наличие в молекулелокального заряда будет приводить к отталкиванию соседних молекул в составе фибриллы.Учитывая предыдущие предпосылки, а также для достижения максимальнойдестабилизации структуры фибриллы, были выбраны пять мутаций sup35,которые несли двойные замены полярных аминокислот на заряженный лизин.Каждая мутация располагалась в одном из повторов с первого по пятый вэквивалентных позициях (Рис.
8-9). Аллели были обозначены общим терминомsup35KK, при этом каждая из них получила название согласно номеруолигопептидного повтора.6.2. Характеристика влияния мутаций sup35KK на свойства приона [PSI+]6.2.1. Мутации PNM2 и sup35-M2 дестабилизируют [PSI+] даже вприсутствии гена SUP35 дикого типаДля работы нами были выбраны два изогенных штамма [PSI+] и [psi-](10-7A-D832 и 7A-D832, соответственно) (Табл. 4).
Эти штаммы несутхромосомную делецию гена SUP35 (SUP35::TRP1), компенсируемую его копией,локализованнойнацентромернойплазмиде.Помимоперечисленного,исследуемые штаммы характеризуются мутациями в генах биосинтеза лейцина иурацила (LEU2 и URA3). Все это позволяет за счет несложных генетическихманипуляций менять и комбинировать различные аллели SUP35 в составевекторов (например, pRSU1 или pRSU2).Мы использовали дрожжевые штаммы с нонсенс-мутацией ade1-14 (UGA),которая позволяет легко выявлять присутствие в клетках фактора [PSI+].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
