Диссертация (1145906)
Текст из файла
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТБИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТКАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИНа правах рукописиБондарев Станислав АлександровичВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ПРИОНИЗУЮЩЕМ ДОМЕНЕ БЕЛКА Sup35НА СВОЙСТВА ПРИОНА [PSI+] ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiaeСпециальность 03.02.07 – генетика.Диссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководительд.б.н., профессор, Г.А. ЖуравлеваСанкт-Петербург20142Оглавление1. Список сокращений.....................................................................................................62. Введение.......................................................................................................................83. Обзор литературы......................................................................................................103.1.
Прионы и амилоиды...........................................................................................103.1.1. Прионы и амилоиды высших эукариот.....................................................103.1.2. Прионы и амилоиды низших эукариот......................................................143.1.3. Амилоиды прокариот..................................................................................173.2. Краткая история исследований фактора [PSI+]................................................183.3. [PSI+] и терминация трансляции.......................................................................193.4. «Жизненный цикл» [PSI+]..................................................................................213.5.
Варианты приона [PSI+].....................................................................................283.6. Структура белка Sup35.......................................................................................313.7. Мутации в гене SUP35, влияющие на стабильность фактора [PSI+].............343.8. Межвидовой барьер для передачи приона [PSI+]............................................363.9. Модели структурной организации агрегатов Sup35p......................................383.10. Заключение........................................................................................................414. Цель и задачи.............................................................................................................425.
Материалы и методы.................................................................................................435.1. Плазмиды.............................................................................................................435.2. Штаммы...............................................................................................................455.3. Среды и условия культивирования...................................................................465.4. Генетические методы.........................................................................................475.4.1. Высокоэффективная дрожжевая трансформация.....................................475.4.2. Выделение геномной ДНК дрожжей S.
сerevisiae....................................485.4.3. Оценка митотической стабильности приона [PSI+]..................................485.4.4. Оценка передачи и потери приона [PSI+]..................................................495.4.5. Подсчет количества пропагонов.................................................................495.4.6. Оценка эффективности нонсенс-супрессии..............................................4935.5. Молекулярно-биологические методы...............................................................505.5.1. Сайт-направленный мутагенез...................................................................505.5.2.
Амплификация ДНК для получения и проверки штаммов с делециейгена RNQ1...............................................................................................................525.5.3. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле(SDS-PAGE)............................................................................................................535.5.4. Неспецифическая окраска белков..............................................................545.5.5. Полуденатурирующий электрофорез белков в агарозном геле(SDD-AGE).............................................................................................................545.5.6.
Вестерн-блот гибридизация........................................................................555.5.7. Секвенирование...........................................................................................555.6. Очистка белков из культур E. сoli.....................................................................555.7. Просвечивающая электронная микроскопия...................................................565.8. Цифровая обработка изображений....................................................................575.9. Статистическая обработка.................................................................................576. Результаты..................................................................................................................586.1.
Теоретические предпосылки для создания мутантных аллелей SUP35........586.2. Характеристика влияния мутаций sup35KK на свойства приона [PSI+]..........606.2.1. Мутации PNM2 и sup35-M2 дестабилизируют [PSI+] даже в присутствиигена SUP35 дикого типа........................................................................................606.2.2.
При отсутствии аллели SUP35 дикого типа мутации sup35KK оказваютразличное влияние на свойства и поддержание приона [PSI+].........................636.2.3. Мутации sup35KK не влияют на стабильность белка Sup35p...................656.2.4. Передача и потеря приона в присутствии мутаций sup35KK....................666.2.5. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 приводят к исчезновению агрегатовSup35p.....................................................................................................................676.2.6. Белки Sup35-M1 и Sup35-M2 включаются в состав прионных агрегатов[PSI+].......................................................................................................................696.2.7. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 могут индуцировать возникновение4приона [PSI+] de novo.............................................................................................706.2.8.
Дестабилизация [PSI+] в присутствии sup35-M2 зависит от количестваклеточных делений................................................................................................716.2.9. Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не влияют на митотическуюстабильность приона [PSI+]..................................................................................736.2.10. Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводят к изменению размераагрегатов Sup35p....................................................................................................746.2.11. Все мутантные аллели незначительно увеличивают стабильностьагрегатов Sup35p при нагревании........................................................................756.2.12.
Мутация sup35-M4 приводит к формированию нового, более«сильного» варианта приона [PSI+]......................................................................776.2.13. Мутация sup35-M5 приводит к уменьшению числа пропагоновв клетке...................................................................................................................786.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+]......806.3.1. Мутации sup35-M2 и sup35-M4 дестабилизируют прион [PSI+] присочетании с другими аллелями sup35KK...............................................................806.3.2.
Дестабилизация [PSI+] в присутствии сочетаний мутаций sup35KKсопровождается увеличением размера агрегатов Sup35p..................................816.3.3. Сочетания мутаций sup35KK модифицируют термостабильностьагрегатов Sup35p....................................................................................................826.4. Зависимость эффектов мутаций sup35KK от варианта приона [PSI+].............836.5. Эффекты мутаций sup35KK не зависят от [PIN+]-статуса клеток....................856.6.
Характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro.......867. Обсуждение................................................................................................................927.1. Влияние мутаций sup35-M1 и sup35-M2 на стабильность [PSI+]...................937.2. Влияние мутаций sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 на свойстваприона [PSI+]..............................................................................................................967.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+]......1007.4. Заключение........................................................................................................10258. Выводы.....................................................................................................................1049.
Список литературы..................................................................................................10510. Благодарности........................................................................................................11861. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ5-ФОК — 5-фтороротовая кислотаа.к. — аминокислотный остатокГГХ — гидрохлорид гуанидинаДМСО — диметилсульфоксидИПТГ — изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидОНПГ — орто-нитрофенил-β-галактозидПЦР — полимеразная цепная реакцияПЭГ — полиэтиленгликольФМСФ – фенилметансульфофторидЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислотаЭПР — электронный парамагнитный резонансЯМР — ядерно-магнитный резонансCARD — caspase-recruitment domain (домен, участвующий во взаимодействии скаспазами)eRF — eukaryotic release factor (эукариотический фактор терминации трансляции)IRF — interferon regulatory factors (факторы, регулирующие синтез интерферонов)GFP — green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок)NF-κβ — nuclear factor κβ (ядерный фактор κβ, транскрипционный фактор)NMD — nonsense mediated mRNA decay (система деградации мРНК спреждевременными стоп-кодонами в открытой рамке считывания)OR — oligopeptide repeats (олигопептидные повторы)PNM — Psi-no-more (мутации, приводящие к потере приона [PSI+])PrP – prion protein (прионный белок)SDD-AGE—semi-denaturatingdetergentagarosegelelectrophoresis(полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле)SDS — sodium dodecyl sulfate (додецил сульфат натрия)SDS-PAGE—sodiumdodecylsulfatepolyacrilamide(денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле)gelelectrophoresis7sup35KK — обозначение аллелей гена SUP35, исследованных в ходе даннойработы: sup35-M1, sup35-М2, sup35-M3, sup35-M4, sup35-M5В работе также использованы стандартные сокращения единиц измерения,общепринятыеобозначениянуклеиновыхкислот,нуклеотидов,атакжекультуральных сред.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
