Автореферат (1145857), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Для выделения изолятов эндофитных бактерий использовали следующую методику. Свежие гаметофиты сфагнума в количестве 5-10 штукобщей массой 5 г промывали в стерильном физиологическом растворе для удалениячастиц посторонних включений и растительных остатков. Затем образцы выдерживали 5 мин в 10% растворе перекиси водорода. Образцы трехкратно отмывали от перекиси в стерильном физиологическом растворе и помещали в стерильные керамические ступки.
Для контроля качества поверхностной стерилизации физраствор из последней серии высевали на поверхность питательного агара (ПА). К растительномуматериалу добавляли 10 мл стерильного физраствора и растирали пестиком до получения однородной кашеобразной массы. Полученную массу методом последовательных серийных разведений высевали на поверхность твердой агаризований среды R2Aс pH=5,7 (табл. 2.6). Посевы инкубировали в течение 5 суток при 20°С, после инкубации подсчитывали общее число выросших колоний, бактерии из морфологически различных колоний методом истощающего посева отсевали на новые чашки Петри, проверяли чистоту культур, описывали культурально-морфологические свойства.
Дляхранения культуры пересевали в пробирки со скошенной агаризованной средой R2A,а также замораживали при -80°С в 20% растворе глицерина.Для молекулярно-генетической идентификации доминантных изолятов бактерий из полученных чистых культур, ДНК выделяли с помощью стандартного метода(лизис лизоцимом и SDS, и последующей фенол-хлороформовой экстракцией). Ам7плификацию фрагментов гена 16S рРНК проводили с использованием праймеровBD1/FD1 (Коростик с соавт., 2006), амплифицированные фрагменты после очистки изгеля секвенировали согласно протоколу фирмы Beckman Coulter (США) для 8-и канального секвенатора SEQ8000 с коммерческим набором «SEQ Dye Terminator CycleSequencing (DTCS) with Quick Start Kit».
Видовую принадлежность изолятов определяли с помощью программы BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).В качестве тест-культур при изучении фунгицидных свойств выделенных изолятов использовали штаммы фитопатогенных и токсигенных грибов: Fusariumgraminearum, Fusarium culmorum, Fusarium sporotrichioides (штаммы из коллекцииВИЗР, предоставлены к.б.н. Т. Ю. Гагкаевой), Alternaria alternata, Pythium ultimum (изколлекции ГНУ ВНИИСХМ). Культуры бактерий-антагонистов наращивали на жидкой среде R2A стационарно при 20°С в течение 3-х суток, фунгицидную активностьопределяли с помощью метода «колодцев» (Magnusson и Schnurer, 2001) на картофельно-декстрозном агаре (Difco, США).Бактерицидную активность проверяли на 4-х штаммах фитопатогенных бактерий: Erwinia carotovora var.
atroseptica 822, Pseudomonas syringae 213, Pseudomonassyringae 8511, Clavibacter michiganensis pv. sepedonicum 6028 (штаммы из коллекцииВИЗР, предоставлены к.б.н. А. М. Лазаревым) с помощью метода «агаровых блоков»(Зенова с соавт., 2002) на 2% картофельном агаре.Для изучения способности штаммов к продукции ауксинов исследуемые изоляты бактерий культивировали 5 суток стационарно при температуре 28°С на жидкойсреде R2A с добавлением 2 mM L-триптофана. Качественную реакцию на ИУК и еепроизводные проводили при помощи реактива Сальковского (Salkowski, 1885; Gordon,Weber, 1951).
Количественный анализ ауксинов в экстрактах культуральной жидкостипроводили с помощью системы ультрапроизводительной жидкостной хроматографии(УПЖХ, UPLC) Waters ACQUITY UPLC H-class с флуоресцентным детектором.Ростстимулирующую активность определяли на проростках кукурузы и редисапо разнице в длине корешков инокулированых и контрольных растений. Способностьвыделенных изолятов эндофитных бактерий к растворению соединений фосфора проверяли на модифицированной среде Муромцева, в которую вносили 2 г/л ортофосфатаCa и фосфоритной муки.
Протеазную, амилазную и липазную активности выявлялистандартными методами для оценки ферментативной активности бактерий (Теппер2004; Нетрусов, 2005). Целлюлазную активность выявляли согласно оригинальнойметодике (Kasana et al., 2008).2.4. Изучение колонизационной, ростстимулирующей, биоконтрольной, фосфатмобилизующей активности выделенных штаммов in planta.
Для выявления способности исследуемых штаммов эндофитных бактерий мхов к активной колонизации высших растений использовали метод инокуляции семян и последующеевыращивание растений в стерильных условиях гнотобиотических систем (Simons et al., 1996). Контрольным штаммом для сравнения колонизационныхсвойств бактерий выбран штамм Pseudomonas chlororaphis RR228 из коллекциилаборатории технологии микробных препаратов ГНУВНИИСХМ, уже используемый при производстве лабораторных образцов микробиологических препаратов. Растительными объектами для изучения служили следующие сельскохозяйственные культуры: пшеница Triticum aestivum (сорт «Веда», селекции Краснодарского НИИ сельского хозяйства), томаты Solanum lycopersicum (сорт «Пер-8сей», агрофирма «Дом семян», Санкт-Петербург) и редис Raphanussativus L.
var. radicula (сорт «Дуро», агрофирма «Дом семян», Санкт-Петербург).Для изучения пространственной локализации бактерий на корнях растений томатов применяли метод флуоресцентной in situ гибридизации и люминесцентноймикроскопии. Для этого, отмытые от песка корешки томатов подготавливали по методике, описанной выше. Гибридизацию проводили с использованием универсальнойбактериальной пробы EUB338 (Amann et.
al., 1990) . Препараты анализировали с помощью эпилюминесцентного микроскопа (Carl Zeiss, Германия).В экспериментах по биоконтролю in planta использовали модельные растительно-микробные системы. Растительными объектами служили растения пшеницы итоматов. В модельных системах искусственно создавался фитопатогенный фон(нагрузка – 10 мл с титром 105 КОЕ/мл): для пшеницы – вносилась культура Fusariumculmorum; для томатов - Pseudomonas syringae pv. tomato.В условиях микровегетационного опыта растения томатов выращивали в сосудах объемом 3 л, в качестве субстрата использовали смесь нестерильного торфогрунта(марка «Терравита», производитель ЗАО «Фарт», Россия) и дерново-подзолистой почвы с опытного поля ГНУ ВНИИСХМ в соотношении 1:1.
Растительными объектамидля изучения служили следующие сельскохозяйственные культуры: томаты Solanumlycopersicum (сорт «Персей», агрофирма «Дом семян», Санкт-Петербург), редисRaphanus sativus L. var. radicula (сорт «Дуро», агрофирма «Дом семян», СанктПетербург). В эксперименте по изучению фосфатмобилизующих свойств, в почвогрунт вносили малорастворимые источники фосфора: ортофосфат Ca и фосфоритнуюмуку в количестве 5 г/кг субстрата и тщательно перемешивали.Изучение влияния целлюлозолитической ассоциации, выделенной из сфагновых мхов, на процессы разложения растительных остатков и баланс гумуса в почвепроводили в лабораторном эксперименте Лаборатории микробной экотехнологииГНУ ВНИИСХМ и микрополевом опыте, заложенном осенью 2011 г.
после уборкиячменя на опытном поле ГНУ ВНИИОУ (Отчет об испытаниях, приложение дисс.работы).2.5. Апробация лабораторных образцов микробиологических препаратов.Лабораторные образцы микробиологических препаратов апробировали на базеКарабалыкской сельскохозяйственной опытной станции (Республика Казахстан) в2012 году на масличных культурах: масличный лен, подсолнечник масличный.Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Эндофитные бактерии – характерные обитатели гаметофитов растений сфагнума.
Современные методы молекулярной биологии и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии, позволили изучить локализацию эндофитных бактерий внутри тканей вегетирующих растений сфагнума. Использование методов FISH иCSLM воссоздает также трехмерную модель (рис. 1, 2) структуры внутренних тканей,населенных бактериальными эндофитами.Благодаря уникальной морфологической структуре вегетативных частей растений сфагнума, которые представляют из себя сочетание живых хлорофиллоносныхклеток и мертвых гиалоцитов, внутри тканей этих растений формируются специфические микрониши для существования эндофитных бактериальных сообществ. В светепредставленных исследований, изменяются и наши представления о функциональныхсвойствах самих тканей гаметофитов сфагновых мхов.
Ранее утверждалось, что бла9годаря губчатой структуре и наличию крупных пор, функция гиалоцитов заключаетсяв запасании воды и последующей ее отдаче растению по мере необходимости. Проведенные исследования последнего десятилетия, в том числе и наши, позволяют с уверенностью сказать, что гиалиновые клетки несут не только водозапасающую функцию, но выполняют роль своего рода микрониш для различных микробных сообществ, обеспечивая функционирование особого, специфического типа симбиотических растительно-бактериальных взаимоотношений.Рисунок1.ЛокализацияAlphaproteobacteriaиPlanctomycetes в гиалоцитахсфагнума.
Показано внутреннеепространство гиалоцитов S.fallax (a, b) и S.magellanicum(c, d). Гибридизация проводиласьсиспользованиемAlphaproteobacteriaиPlanctomycetesспецифичныхпроб. Желтый: Alphaproteobacteria (a, c) или Planctomycetes (b,d); красный: другие эубактерии.Масштабная линейка: 10 (a, b) и5 (c, d) мкм. (Bragina A., Berg C.,Cardinale M., Shcherbakov A. etal., 2012)Рисунок 2. Локализация микроколоний бактерий в гаметофитахсфагнов. Флуоресцентная in situгибридизация веточных листьевc групп-специфичными (белыестрелки) бактериальными пробами выявила колонизациювнутреннего пространства гиалиновых клеток сфагнов бактериями классов Betaproteobacteria (A) иGammaproteobacteria (B). Изображения, полученные при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопa, представлены в 3 проекциях. Масштабная линейка - 10 мкм.Использование универсальных и группспецифичных олигонуклеотидных пробпозволило визуализировать представителей Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria,Planctomycetes, населяющих ткани сфагнов (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
