Автореферат (1145854), страница 2
Текст из файла (страница 2)
В гониальных клетках ди- и триплоидныхгибридных головастиков происходит селективная элиминация генома, котораявовлекает гетерохроматинизацию и формирования микроядер.Публикации. Материалы исследования изложены в 10 научных работах, в томчисле в 3 статьях.Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения,выводов и списка цитируемой литературы, включающего 270 ссылок.
Материалыдиссертации изложены на 165 страницах машинописного текста, содержат 1таблицу и иллюстрированы 17 рисунками. В приложения вынесены 2 таблицы и 1рисунок.МЕТОДЫ И ПОДХОДЫ К РЕШЕНИЮ ПОСТАВЛЕННЫХ ЗАДАЧСбор материала. В качестве объектов исследования были выбраны ди- итриплоидные гибриды, а также особи P.
ridibundus, отловленные из популяционныхсистем типа R-E в бассейне реки Северский Донец (Восточная Украина). ОсобиP. lessonae были отловлены из бассейна реки Днепр, который является ближайшимместом обитания P. lessonae к центрам формирования гибридов (Коршунов, 2009).Идентификациягенотиповвзрослыхживотных.Идентификациюродительских видов, а также всех форм гибридных животных проводили путемизмерения количества ДНК клеток с помощью проточной ДНК-цитометрии по7методике, предложенной Боркином с соавторами (Боркин и др., 1987) иВиноградовым с соавторами (Vinogradov et al., 1990).Постановка скрещиваний. Для постановки скрещиваний были сформированыпары гибридных животных друг с другом и особями P. ridibundus. Для стимуляциинереста животные были инъецированы 400 мкл сурфагона (синтетического аналогагонадолиберина) с концентрацией 5 мкг/мл (Browne et al., 2000; Kouba et al., 2009).Анализ кариотипов на стадии хромосом типа ламповых щеток.
Препаратыхромосом типа ламповых щеток (ЛЩ) были получены из ооцитов P. ridibundus,P. lessonae, а также ди- и триплоидных P. esculentus по стандартной методике,описанной Г. Калланом и соавторами (Callan et al., 1987) с модификациямиДж. Голла и соавторов (Gall et al., 1991). Идентификация хромосомных наборов,передаваемых в ооцитах гибридов, была проведена с использованиемсконструированных цитологических карт (Dedukh et al., 2013).Получение препаратов метафазных хромосом. Препараты метафазныххромосом были получены из тканей головастиков, появившихся в результатеискусственных скрещиваний, и взрослых животных по стандартной методике(Macgregor, Varley, 1986).Иммунофлуоресценное окрашивание.
Иммунофлуоресцентное окрашиваниепроводили на препаратах хромосом типа ламповых щеток. В качестве первичныхантител использовали моноклональные антитела (мАТ) мыши и поликлональныеантитела (пАТ) кролика в концентрации согласно рекомендациям авторов илипроизводителей: мАТ No-185 против No-38 (Schmidt-Zachmann, Franke, 1988), мАТNo114 против белка Nopp-140 (Schmidt-Zachmann et al., 1984), мАТ 17с12 противфибрилларина (Pollard, 1997), мАТ 38F3 против фибрилларина (Santa CruzBiotechnology), мАТ K121 против 2,2,7-метил гуанозинового кэпа мяРНК (Krainer,1988), мАТ Y12 против симметричного диметиларгинина (Lerner et al., 1981), пАТH-300 (Santa Cruz Biotechnology) и пАТ R288 и против С-концевого домена коилина(Andrade et al., 1991).
В качестве вторичных антител использовали антитела противIgG, IgM мыши и IgG кролика, конъюгированные с флуорохромом Alexa 488 илиCy3. Для заключения использовали среду, содержащую фотопротектор (DAВCO,Мerck) и DAPI (1 мкг/мл) (Sigma).3D иммунофлуоресцентное окрашивание проводили на диссектированныхгонадах головастиков. Для проникновения антител ткани гонад инкубировали в 1%ном растворе Triton X100 на 1×PBS в течение 3-х часов. В качестве первичныхантител использовали антитела ab1220 против H3K9Me2 (Abcam), ab8898 противH3K9Me3, (Abcam), ab6002 против H3K27Me3 (Abcam), и 06-866 противацетилированного гистона Н4 (Upstate). В качестве вторичных антител8использовали антитела против IgG, IgM мыши и IgG кролика, конъюгированные сфлуорохромом Alexa 488 или Cy3.Флуоресцентная in situ гибридизация.
Флуоресцентную in situ гибридизацию(FISH) проводили на препаратах метафазных хромосом, а также препаратаххромосом типа ламповых щеток (Solovei et al., 1994). В качестве зондовиспользовали: меченые биотином олигонуклеотидные зонды к теломерному повтору(AATCCC)5-биотин и (TTAGGG)5-биотин; меченый флуорохромом Cy3олигонуклеотидныйзондCy3-5`-AAGCCGATTTTAGACAAGATTGC-3`кцентромерному повтору RrS1. При проведении FISH на метафазных хромосомахпрепараты предобрабатывали РНКазой А, пепсином с последующей постфиксациейв 2% параформальдегиде.
При проведении FISH на хромосомах типа ЛЩ препаратыпредобрабатывали РНКазой А, но не пепсином. После денатурации хромосом притемпературе 81,5 °C проводили гибридизацию на протяжении ночи при комнатнойтемпературе (Solovei et al., 1994). Детекцию биотина проводили при помощиавидина, конъюгированного с флуорохромом Cy3 (Jackson Immuno ResearchLaboratories). Препараты заключали в среду, содержащую фотопротектор (DAВCO,Мerck) и DAPI (1 мкг/мл) (Sigma).3D FISH с олигонуклеотидными зондами к центромерному и теломерномуповторам проводили на тканях гонад, диссектированных из головастиков.
Дляулучшения проникновения зонда ткани гонад инкубировали в 1%-ном раствореTriton X100 на 1×PBS в течение 3-х часов.Флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопия. Препараты метафазныххромосом и хромосом типа ламповых щеток получали при помощифлуоресцентного микроскопа Leica DM 4000В с соответствующими фильтрами дляфлуорохромов Alexa 488, Cy3 и DAPI (Leica Wetzlar GmbH, Germany). Дляполучения и обработки цветных изображений использовали программу Leica CW4000 FISH.Лазернаясканирующаяконфокальнаямикроскопия.Анализдиссектированных гонад головастиков проводили с помощью лазерногосканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Germany, LeicaMicrosystems CMS GmbH) с программным обеспечением LAS AF (LeicaMicrosystems).
Для возбуждения флуорохромов использовали диодный (405 нм),аргоновый (488 нм) и гелий-неоновый (543 нм) лазеры.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕОтличительные черты хромосом типа ламповых щеток P. ridibundus иP. lessonae из популяций бассейна реки Северский ДонецДля того чтобы идентифицировать геномы, передаваемые с гаметами ди- итриплоидных гибридных животных, мы провели детальный анализ хромосом типа9ламповых щеток, выделенных из ооцитов P. ridibundus и P.
lessonae, взятых изпопуляций бассейна реки Северский Донец. Мы установили расположениемаркерных структур на хромосомах типа ЛЩ обоих родительских видов,локализовали ядрышковый организатор, локусы формирования коилин-содержащихтелец, центромерные районы, а также интерстициальные сайты теломерногоповтора. Положение маркерных структур отразили в цитологических картах,сконструированных для всех 13 хромосом типа ЛЩ обоих родительских видов(Dedukh et al., 2013).
Сконструированные карты наглядно демонстрируют различиянаборе и расположении маркерных структур на хромосомах типа ЛЩ между обоимиродительскими видами. Хромосомы типа ламповых щеток P. ridibundus и P. lessonaeразличаются по числу и локализации маркерных структур, формированиюассоциированного с хромосомой ядрышка, присутствию интерстициальных блоковпоследовательности, содержащей фрагмент (TTAGGG)n (Рисунок 1е,ж).Элиминация и эндорепликация геномов в гаметогенезе триплоидныхгибридных самокДля того чтобы охарактеризовать эндорепликацию и элиминацию геномов воогенезе гибридных животных, мы провели анализ кариотипов, передаваемых сооцитами гибридных лягушек различной плоидности.
Ооциты, полученные из 14триплоидных гибридных самок с генотипом RRL, содержат 13 бивалентов,соответствующих хромосомам типа ЛЩ P. ridibundus. Ооциты 3 триплоидныхгибридных самок с генотипом LLR содержали 13 бивалентов, соответствующиххромосомам типа ЛЩ P. lessonae. Таким образом, триплоидные самки P. esculentus сгенотипами RRL и LLR элиминируют геном, представленный одной копией, ипроизводят ооциты с двумя оставшимися гомологичными геномами, которыеформируют 13 бивалентов (Рисунок 2а) (Dedukh et al., 2015).
Наши результатысоответствуют данным, полученным для триплоидных гибридов P. esculentus изцентрально-европейских популяционных систем (Graf, Polls-Pelaz, 1989; Plötner,2005; Christiansen, Reyer, 2009; Pruvost et al., 2013).Переход к полиплоидным гибридам создает дополнительные сложности дляпрохождения гаметогенеза, которые требуют изменений в процессах элиминации иэндорепликации геномов. Мы обнаружили редких триплоидных самок P.
esculentus,производящих разнообразные ооциты: ооциты с 26 уни- или бивалентами, ооцитыс39 уни- или бивалентами и ооциты, в которых одновременно присутствуют би- иуниваленты. Такие ооциты позволяют оценить прохождение геномной элиминациии эндорепликации во время оогенеза триплоидных гибридных лягушек. Для тогочтобы сформировать ооциты с 26 бивалентами, в гаметогенезе триплоиднойгибридной самки должна была произойти элиминация одного генома, с10Рисунок 1. Различия между хромосомами P.
ridibundus и P. lessonae на примере метафазныххромосом и хромосом типа ламповых щеток. (a-в) Картирование повтора (TTAGGG)n с помощьюFISH на метафазных хромосомах P. lessonae (a, a`), P. ridibundus (б) и диплоидной P. esculentus (в),а также на хромосомах типа ламповых щеток H P. ridibundus (е) и P. lessonae (ж). Звездочкаобозначает увеличенный фрагмент с двумя ядрышкообразующими хромосомами P. lessonae.Стрелками (для а-в) и квадратными скобками (для е,ж) отмечены один или два интерстициальныхсайта повтора (TTAGGG)n, которые различимы на ядрышкообразующей хромосоме. Головкистрелок указывают на центромеры.
(г, д) Детекция центромерного повтора RrS1 с помощью FISHна препаратах хромосом P. ridibundus (г) и P. esculentus (д). Масштабный отрезок = 10 мкм длявсех микрофотографий кроме a`, где масштабный отрезок = 2 мкм.последующим раундом эндорепликации оставшихся геномов. В то же время, вооцитах с 26 унивалентами прошел только раунд элиминации генома без этапаэндорепликации. Геномная эндорепликация во время гаметогенеза у триплоидныхгибридных самок без этапа элиминации ведет к формированию ооцитов с 39бивалентами (Dedukh et al., 2015). Следует отметить, что такие аномальные длязеленых лягушек ооциты являются обычными для партеногенетических игиногенетических триплоидных гибридов позвоночных животных, которыепроизводят нередуцированные гаметы, способные развиваться без оплодотворения(Yamashita et al., 1993; Stenberg, Saura, 2009; Neaves, Baumann, 2011).Элиминация и эндорепликация геномов в гаметогенезе диплоидныхгибридных самокМы также идентифицировали геномы, передаваемые с ооцитами диплоидныхгибридных лягушек.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
