Автореферат (1145768), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Изменение концентрации меди в органах и субклеточных фракцияхпечени АЭ крысКонцентрация меди была измерена в печени крыс и сопоставлена с таковойдля почек и гипоталамуса. В печени, корковом слое почек и гипоталамусе –органах, характеризующихся интенсивным метаболизмом меди, АЭ приводит кувеличению концентрации меди (рисунок 2 А). В то же время, концентрациямеди в мозговом слое почек не изменяется.А – концентрация меди в органах крыс. П – печень, КСП – корковый слой почек, МСП –мозговой слой почек, Г – гипоталамус. Б – концентрация меди в субклеточных фракцияхгепатоцитов ЛО и АЭ крыс. Я – ядра, М – митохондрии, АГ – аппарат Гольджи, Ц – цитозоль.В – концентрация меди в субклеточных фракциях гепатоцитов ЛО крыс. * p < 0.05Рисунок 2 – Содержание меди в органах и субклеточных фракциях гепатоцитовкрыс (n = 3)Измерение концентрации меди во внутриклеточных фракциях гепатоцитов,полученных методом дифференциального центрифугирования показало, что АЭприводит к снижению концентрации меди в митохондриях и повышению вцитозоле (рисунок 2 Б).
Так как 20-часовой диализ не приводит к снижениюконцентрации меди в исследуемых фракциях (рисунок 2 В), можно считать, чтоосновная часть меди в клетке прочно связана с субстанциями, молекулярнаямасса которых превышает 800 Да.1.3. Влияние АЭ на распределение меди в цитозоле гепатоцитовФракционирование цитозоля методом гель-фильтрации на колонке сСефадексом G75 показало, что материал, поглощающий на 280 нм, элюируетсячетырьмя пиками: мажорные пики I и II, минорный пик III и пик IV (рисунок 3А). У ЛО крыс большая часть меди соответствует мажорным пикам I и II(рисунок 3 Б). В цитозоле АЭ крыс значительная часть меди содержится вофракциях, принадлежащих мажорным пикам, однако ее содержаниеувеличивается в пиках III и IV.Как показал анализ методом иммуноблотинга, медь, содержащаяся в пике I,связана с белками сыворотки крови, попавшими во фракции при гомогенизацииобразцов печени.
В соответствии с результатами определения СОД активности в10геле (рисунок 3 В), медь из пика II должна быть связана с цитозольнымкупроэнзимом СОД1. Активность СОД в пике II контрольных крыс выше, чем уАЭ животных. Во фракциях цитозоля АЭ, но не ЛО, крыс, соответствующихпику IV, выявляется вещество неизвестной природы, обладающее СОДактивностью (рисунок 3 В). Денатурирующие и восстанавливающие агенты, атакже высокая температура вызывают диссоциацию этой субстанции (рисунок 3Б, врезка).А – профиль элюции белков цитозоля.
I, II, III и IV – номера пиков. Стрелка указывает наэлюцию цитохрома с. Врезка – молекулярно-весовой анализ белков (сверху) и содержание ЦП(снизу) во фракциях цитозоля клеток печени АЭ крыс. М – маркеры молекулярных весов. Б –распределение меди по фракциям цитозоля гепатоцитов ЛО и АЭ крыс. Врезка – ДСНэлектрофорез фракции #53, соответствующей пику IV, из цитозоля гепатоцитов АЭ крыс.Обработка проб: 1 – ДСН, β-меркаптоэтанол (МЭ) и нагревание при 95 °C; 2 –ДСН и МЭ; 3 –ДСН и нагревание при 95°C; 4 – ДСН.
В – СОД активность во фракциях цитозоля гепатоцитовЛО и АЭ крыс (изображения инвертированы)Рисунок 3 – Характеристика хроматографических фракций цитозоля гепатоцитовЛО и АЭ крысАЭ не влияет на содержание иммунореактивных полипептидов СОД1 вобщей фракции цитозоля, однако активность СОД1 уменьшается (рисунок 4 А),поэтому соотношение холо-СОД1/апо-СОД1 у АЭ крыс снижено (рисунок 4 Б).Так как включение атомов меди в белок СОД1 происходит при помощи CCS,специального Cu(I)-шаперона, который получает медь в межмембранномпространстве митохондрий (Leary et al., 2009), можно думать, что уменьшение11содержания меди в митохондриях, спровоцированное АЭ,наблюдаемому снижению содержания холо-СОД1.приводиткА – иммуноблотинг с антителами к СОД1 (сверху); ПААГ, окрашенный нитротетразолиемсиним для выявления ферментативной активности СОД1 (снизу). Б – денситометрическийанализ представленных выше гелей (А) и отношение холо-СОД1/апо-СОД1.
** p < 0.01Рисунок 4 – Содержание и активность СОД1 в цитозоле печени крыс (n = 3)Содержание полипептидов МТ и COMMD1 не изменяется в цитозолегепатоцитов АЭ крыс (рисунок 5 А). В то же время, концентрация меди виммунопреципитатах, полученных из цитозоля с помощью антител к МТ, послеАЭ увеличивается. Это означает, что происходит увеличение нагрузки МТ медью(рисунок 5 Б).А – иммуноблотинг co специфическими антителами к МТ и COMMD1 (n = 3). Б –денситометрический анализ представленных выше гелей. В – содержание меди во фракции,ассоциированной с МТ в печени крыс (n = 5).
* p < 0.05Рисунок 5 – Содержание МТ и COMMD1 в цитозоле печени ЛО и АЭ крыс иконцентрация меди во фракции МТВ митохондриальной фракции в результате АЭ по данным иммуноблотингане происходит изменения содержания полипептидов COX4. Это косвенноуказывает на целостность ансамбля цитохром-с-оксидазы (ЦО), так какнарушение первых стадий сборки комплекса, вызванное дефицитом меди,приводит к остановке сборки и подавлению активности ядерных генов,кодирующих субъединицы фермента.121.4. Анализ митохондриальной фракции клеток печени ЛО и АЭ крысФракции митохондрий, изолированные методом дифференциальногоцентрифугирования, были дополнительно очищены методом равновесногоультрацентрифугирования.
Полученные фракции содержат митохондриальнуюДНК (мтДНК), зрелые полипептиды COX4 и цитохрома с (рисунок 6). Вцитозоле присутствует пре-пептид COX4, а цитохром с обнаруживается лишь вследовых количествах. Данные показывают, что полученные фракциимитохондрий являются высокоочищенными.А – содержание мтДНК во фракции митохондрий гепатоцитов ЛО (1) и АЭ (2) крыс. 3 –маркеры. Б – содержание полипептидов белков COX4 и цитохром с, определенное методомиммуноблотинга. Фракции были выделены из печени ЛО (1, 3, 5, 7) и АЭ (2, 4, 6, 8) крыс. 1, 2,5, 6 – митохондрии; 3, 4, 7, 8 – цитозоль; 9 – коммерческий препарат цитохрома с лошадиРисунок 6 – Содержание мтДНК (А) и белков COX4 и цитохром с (Б) вмитохондриальной фракции гепатоцитов крысПо данным двумерного электрофореза, общая картина распределения белковв исследуемых фракциях соответствует митохондриальному протеому, однаконаблюдаются различия между протеомами фракций АЭ и ЛО крыс: вмитохондриях АЭ крыс в областях рН 8.5 – 9.0, молекулярный вес 30 – 35 кДа ирН 3.5 – 4.0, молекулярный вес 10 – 13 кДа утрачивается продукт.
В области рН4.0, молекулярный вес 130 кДа у АЭ животных появляются три пятна, а вобласти рН 7, молекулярный вес около 200 кДа в мажорной зоне выявляетсязначительная разница, состоящая в конфигурации зоны.1.4.1. Влияние АЭ на гетерогенность популяции митохондрий печени крысМетодом дифференциального центрифугирования гомогенат печени ЛО иАЭ крыс был разделен на ядерную и митохондриальную фракции, которые былиочищены в градиенте плотности сахарозы. После ультрацентрифугированияядерной фракции зона на границе 42-45% концентраций сахарозы была собрана вдве фракции объемом по 1 мл: Я1 и Я2, соответственно “легкая” и “тяжелая”.Материал митохондриальной фракции распределился от 41% до 45% сахарозы, вэтом диапазоне было собрано по 12 фракций объемом 1 мл: фракции 1 – 12 (Ф1 –Ф12). Определение содержания общего белка во фракциях показало, что у АЭживотных существенно меньше митохондрий низкой плотности. Во фракциинизкоседиментирующих митохондрий тотальное содержание белка у ЛОживотных почти в 2 раза выше, чем у АЭ крыс.
“Легкая” и “тяжелая” фракциимитохондрий у ЛО крыс представлены примерно в одинаковом количестве, в то13время как у АЭ крыс “легкая” фракция превалирует над “тяжелой”.Иммуноблотинг с антителами к COX4 и ПЦР с праймерами на вариабельныйучасток мтДНК показал, что все полученные фракции содержат СОХ4 (рисунок 7А), однако во фракциях Я1 и Я2 АЭ животных мтДНК не обнаружена (рисунок 7Б).М – маркер. Наиболее яркая полоса соответствует 500 п.н.Рисунок 7 – Содержание COX4 (А) и мтДНК (Б) во фракциях митохондрийРезультаты настоящего исследования свидетельствуют, что удалениенадпочечников приводит к изменениям в соотношении митохондриальныхсубпопуляций печени, в частности, происходит снижение размеровсубпопуляции митохондрий, седиментирующей с ядрами.1.5.
Исследование транскрипционной активности генов, кодирующих белкиМСМ, в печени АЭ крысРанее было показано, что введение гормонов надпочечников не отменяетэффекта АЭ на нарушение экскреции меди из печени (Gregoriadis and Sourkes,1969). В работе проведен компьютерный поиск цис-элементов, регулируемыхгормонами надпочечников в промоторных областях генов крысы, кодирующихбелки, вовлеченные в метаболизм меди. В рассмотрение взяты следующиегруппы генов: (1) гены, кодирующие медь-транспортные белки (Ctr1, Ctr2, Atp7a,Atp7b, и Ccs), (2) гены, кодирующие купроэнзимы (Cp, ген, продуктами которогоявляются секреторный ЦП, а также его сплайс-изоформа ГФИ-ЦП, Sod1, Cox4i1,Pam), и (3) гены, продукты которых поддерживают внутриклеточный гомеостазмеди (Mt1a и Commd1). Катехоламины изменяют активность генов, содержащихв промоторной области CRE-последовательность (cyclic-AMP responsive element).Глюкокортикоиды коры надпочечников изменяют активность генов, содержащихв промоторной области GRE элементы (glucocorticoid-responsive element).
Поискэтих последовательностей осуществляли на расстоянии 3000 п. н. upstream от +1нуклеотида. Для поиска CRE последовательность TGACGTCA, не было14обнаружено ни одного полного совпадения. Полных совпадений сканоническимиGREпоследовательностямиGGTACANNNTGTTCTиAGAACANNNTGTTCT также не было обнаружено.Экспрессия выше перечисленных генов была оценена методомполуколичественного ОТ-ПЦР анализа. Было показано, что АЭ не приводит кизменению уровней экспрессии генов, кодирующих белки метаболизма меди.В совокупности, данные, полученные в этом разделе, позволяют считать, что1) АЭ приводит к задержке экскреции меди из печени, накоплению меди вцитозоле в составе МТ и в субстанции неустановленной природы; 2) АЭ вмитохондриях вызывает снижение концентрации меди, не связанной с ЦО, иизменяет соотношение между субпопуляциями митохондрий; 3) протеоммитохондрий АЭ крыс отличается от такового у ЛО животных; 4) АЭ снижаетуровень металлирования СОД1; 5) формирование холо-ЦП в цистернальномпространстве аппарата Гольджи увеличивается.
Ни одно из этих изменений несвязано с изменением активности генов, ассоциированных с метаболизмом меди.2. Характеристика метаболизма меди в надпочечникахВторая часть исследования сосредоточена на выявлении особенностейметаболизма меди в надпочечниках и печени крыс на ранних этапахпостнатального развития.2.1. Концентрация меди в печени и надпочечниках крыс в период раннегопостнатального развитияКонцентрацию меди в печени и надпочечниках определяли у крыс с 1-го по15-ый дни жизни, а также в печени крыс в 1 и 4 дни до рождения (рисунок 8 А).А – концентрация меди в печени крыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
