Автореферат (1140903), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Экспериментальным путем была установленаоптимальная температура отжига праймеров – 530С и число цикловамплификации (40) обеспечивающих получение наибольшего количестваПЦР продукта.Выбраны и синтезированы праймеры для диагностики DirofilariaиrepensD.immitis.Подобранынаиболееэффективныережимыамплификации для этих праймеров. Использование созданных нами ПЦРдиагностикумов дирофиляриоза доказало свою эффективность в диагностикеподкожного дирофиляриоза человека. С использованием наших праймероввпервые в России удалось выявить заболевание человека системнымдирофиляриозом, вызванным D.immitis.Новымважнымдлязадачэпидемиологическогонадзоразапаразитарными болезнями стала разработка методологии определенияуровня зараженности дирофиляриями переносчиков – комаров родов Culex,Aedes и Anopheles на основе постановки ПЦР.Сцельюоптимизациимониторингаиэкспрессдиагностикинетрансмиссивных паразитозов были выбраны праймеры для обнаружениягенома криптоспоридий и лямблий в клиническом материале, питьевой водеи объектах среды обитания человека.
Для Cryptosporidium parvumоптимальнойтемпературойотжигаявляется450С,числоцикловамплификации – 35. Соответствующие параметры для Lamblia intestinalisсоставили – 620С и 450 циклов амплификации.Праймеры для диагностики амебиаза подбирали по базам данныхгенетической информации Genbank с помощью компьютерной программыBlast о нуклеотидной последовательности генома Entamoeba histolytica и поматериалам собственных клинических исследований. В результате быливыбраны прямой и обратный праймеры. Для детекции паразитов Entamoeba21histolytica оптимальной температурой отжига праймеров является 650С, аувеличениеколичествапродуктаПЦРдостигаетсяпри35циклахамплификации.Принципиально новые для науки данные были получены нами идругими сотрудниками НИИМПиТМ им.
Е.И. Марциновского в отношениипатогенного простейшего Blastocystis hominis, до недавнего временисчитавшегося непатогенным. В этих исследованиях было показано, чтоB.hominis не только ассоциируется с патологией желудочно-кишечноготракта,ноиможетвызыватьгенерализованнуюпатологиюуиммунокомпрометированных субъектов. Во всех таких случаях диагнозбластоцистозаставилсянаоснованиимикроскопическихиПЦРисследований.Для этого нами были выбраны и синтезированы праймеры длядиагностикиB.hominis.Подобранынаиболееэффективныережимыамплификации для этих праймеров.Из36микроскопическиподтвержденныхлиц,выделявшихбластоцист, у 32 наличие бластоцист в фекалиях было подтверждено в ПЦР соригинальным набором праймеров Bh1 и у 34 – с оригинальным наборомпраймеров Bh2.
Полученные результаты свидетельствуют о высокой степенисовпадения результатов в ПЦР с обоими использованными праймерами иклассических микроскопических исследованиях.ИспользованиесозданноговНИИМПиТМПЦР-диагностикумабластоцистоза доказало свою эффективность не только в диагностикебольных, но и в процессе обследования декретированных контингентов.Выделителибластоцистсоставилиоколо9,2%среди337плановообследованных лиц, проходивших регулярный профилактический осмотр иобследованиенаналичиевозбудителейкишечныхинфекций(«декретированные контингенты»). Среди лиц, выделяющих бластоцисты,достоверно чаще выявлялась сопутствующая кишечная патология, что можнорасценить, как проявление патогенности бластоцист или повышенный риск22инвазирования этими паразитами на фоне хронических заболеванийжелудочно-кишечного тракта.
Только у трех выделителей бластоцистжалобы на состояние здоровья отсутствовали.9,20%1,50%1,20%Blastocystis hominisEntamoeba coliDientamoeba fragilisпростейшие не выявлены88%Рисунок 1− Результаты выявления простейших в кале пациентовпри профилактических осмотрахНаиболее высокие показатели инфицированности B.hominiss былиустановлены при хроническом холецистите – 16,1±6,6%, при бронхиальнойастме – 12,9±6%, что позволяет рассматривать данных простейших какэтиопатогенетический ко-фактор развития этих заболеваний.Не всё так однозначно оказалось с ПЦР-диагностикой такогомассового и социально значимого паразитоза, как токсоплазмоз.
В настоящеевремя в России выпускается несколько коммерческих тест-систем для ПЦРдиагностики токсоплазмоза. В качестве материала для исследования винструкциикэтимтест-системампредлагаетсяисследоватькровь,амниотическую жидкость и слезную жидкость.Токсоплазмы крайне редко присутствуют в кровеносной системе дажев период активных клинических проявлений. Тем более паразита нет в кровиво время латентной стадии бессимптомного токсоплазмоза.
Поэтому ни уоднойиз150обследованныхнамиженщинссерологическиверифицированным диагнозом токсоплазмоз в пробах крови не было23обнаружено фрагментов генома Toxoplasma gondii с помощью реакции ПЦР.48 исследований было выполнено с помощью ПЦР в реальном времени.Проведенный комплекс разноплановых экспериментальных иэпидемиологических исследований обеспечил создание широкого спектраактуальных ПЦР-диагностикумов для индикации и идентификациигеномов и фрагментов геномов патогенных простейших и гельминтов, какв клиническом материале, так и при проведении полевых исследований вочагахпаразитарныхболезнейвразныхклимато-географическихпровинциях умеренного и субтропического климата.Созданные ПЦР-диагностикумы позволяют выявлять наличиевозбудителейтрансмиссивныхлейшманиозы,дирофиляриозы)паразитарныхиболезнейпаразитозов(малярия,нетрансмиссивнойприроды (лямблиоз, амебиаз, бластоцистоз, криптоспоридиоз).Помимо клинической лабораторной работы очень перспективнымпредставляетсяиспользованиемолекулярныхметодоввэпидемиологических исследованиях.
Апробация ПЦР-диагностикумов вочагах трансмиссивных паразитозов позволила получить важные длянауки и практики эпиднадзора данные о сроках функционирования очагови достоверности отсутствия передачи возбудителей на конкретныхтерриториях.Дляцелейэпидемиологическогонадзоразатропическимиболезнями была создана тест-система для диагностики лихорадки Зика вклиническомибиологическомматериале.ТаккакПЦРширокоприменяется для диагностики заболеваний, вызванных флавовирусами иявляетсябыстрым,чувствительнымиспецифичнымметодом,мыразработали набор реагентов, основанный на одностадийной ОТ-ПЦР-РВ,для детекции РНК вируса Зика. Для выбора гена-мишени был проведенсравнительный анализ геномов как близкородственных вирусов (вирусовДенге типов 1,2,3,4; Японского энцефалита; лихорадки Западного Нила;Желтой лихорадки; Спондвени), так и известных последовательностей24вируса Зика.
Исходя из результатов анализа в качестве гена-мишени былвыбран регион NS2B-NS3, который отвечал требованиям специфичности поотношению к близкородственным вирусам, так и гомогенности внутриштаммов вируса Зика. Были проведены необходимые технические иклинические испытания разработанной тест-системы по окончании которой«Набор реагентов для обнаружения РНК вируса Зика (Zika virus) методомполимеразной цепной реакции «ФЛАВИСКРИН-ZIKV» был официальнозарегистрирован Росздравнадзором.ВТОРОЕ ПОЛОЖЕНИЕ.
Использование методов молекулярнойпаразитологиипозволилораспространениипатогеновполучитьобъективныепаразитарнойприроды,данныеооценитьирассчитать уровень риска заражения возбудителями паразитарныхболезней за счет индикации, идентификации и количественногоопределения степени контаминации абиотических объектов средыобитания человека (рекреационные водоемы, источники и системыхозяйственно-питьевого водоснабжения, продукты питания, бытовыеотходы, хозяйственно-фекальные сточные воды),возбудителямипаразитарныхболезнейи зараженностибиологическихобъектов,играющих роль промежуточных хозяев и переносчиков.Широкиеперспективыприменениямолекулярныхметодовоткрываются при проведении массовых обследований населения дляустановления истинных уровней пораженности различных контингентовпаразитозами.
Для этих целей более целесообразным представлялосьиспользование не моно-ПЦР-диагностикумов, а комплексная система,позволяющая одновременно осуществлять ПЦР-диагностику важнейших,наиболее массовых для нашей страны кишечных протозоозов (лямблиоз,амебиаз, бластоцистоз, криптоспоридиоз).В процессе создания комплексной системы ПЦР-диагностики былсоставленнабороптимальныхпраймеров25кчетыремосновнымвозбудителям кишечных протозоозов в сочетании с выпускаемымотечественноймикробиологическойпромышленностьюнаборомреагентов для ПЦР (PCR-core).
Следует отметить, что представленнаякомплексная система может использоваться в постановке классическойПЦР и легко адаптируется для ПЦР в реальном времени путем добавленияв реакционную смесь реагента SybrGreen.Практическая апробация созданных ПЦР-диагностикумов былаосуществлена в серии полевых эпидемиологических исследований,выполненных в разных очагах паразитарных болезней.В некоторых ситуациях, особенно при возникновении эпидемическихосложнений, применение ПЦР может стать критической технологией воперативномустановлениивспышкинепосредственномиэтиологическойэкстренномпричиныэпидемическойпринятииоптимальногоуправленческого решения по купированию эпидемического осложнения и недопущению дальнейшего распространения заболеваемости и увеличениячисла больных.Экономически обоснованным решением для работы в условияхотсутствия стационарных ПЦР-лабораторий в отдаленных районах нашейстраны, может стать разработка и создание мобильных ПЦР лабораторий,оснащенныхстандартнымнаборомапробированногооборудования,смонтированного на базе доступных, выпускаемых промышленностьюпередвижных платформ на колесном или гусеничном ходу.Указанный подход способен обеспечить повышение эффективностиэпидемиологического надзора за паразитарными болезнями и укрепитьвозможности органов и учреждений Роспотребнадзора и Министерстваздравоохранения России в области борьбы с паразитарной патологией наосновеповсеместногоиспользованияновыхинформационныхтелекоммуникационных технологий и инновационных диагностическихсистем.26В соответствии с этими задачами нами была создана и обоснованарабочая концепция мобильной ПЦР лаборатории для целей усиленияпрофилактических и противоэпидемических мероприятий по сокращениюсоциального и экономического ущерба от массовых и социально значимыхпаразитозов.
В дальнейшем в содружестве и кооперации со специалистамиГАОУ ВПО Московский физико-технический институт (МФТИ) быларазработанарабочаяпаразитологическойконструкторскаялабораториинабазедокументацияавтобусамобильнойПАЗ,серийновыпускающегося ОАО «Павловский автобус».В предлагаемом нами совместно с инженерным корпусом МФТИнаучно-конструкторскимлабораториярешениемоснащаетсямолекулярно-биологического,паразитологическогопроизводства.исчерпывающимпаразитологическаянаборомэнтомологическогооборудования,Указанныймобильнаянаборипреимущественнопризванобеспечитьсовременногосанитарноотечественноговозможностькомплексного выполнения оптимально необходимого набора экстренныхлабораторных и диагностических исследований, необходимых для принятияоперативных управленческих решений по купированию неблагоприятнойэпидемической ситуации на основе полученных достоверных данных обэтиологической причине вспышки и основных задействованных факторахпередачи возбудителя паразитарной болезни, приведшей к возникновениюэпидемической вспышки.27Рисунок 2− 3D модель мобильной паразитологической лабораторииВлабораториипредусмотренырабочиеместамикроскописта,молекулярного паразитолога и энтомолога (рисунок 1).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
