Диссертация (1140821), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Онподавляет в крови реакцию превращения протромбина в тромбин. Определениеволчаночного антикоагулянта проводилось в 3 этапа (Stago, Франция):скрининговые методы осуществлялись с помощью фосфолипид-зависимыхтестов: АЧТВ с низким содержанием фосфолипидов, время разведенного ядагадюки, протромбиновое время с разведенным тромбопластином. Скрининговаяпроба на выявление ВА считалась отрицательной, если фосфолипид-зависимыетесты были нормальными, в свою очередь удлинение фосфолипид-зависимыхтестов свидетельствовало о необходимости проведения коррекционной пробы.Коррекционная проба осуществлялась путем смешивания исследуемой плазмы с55нормальной плазмой в соотношении 1:1; 1:4 и 4:1 соответственно с цельюисключения дефицита факторов. Если фосфолипид-зависимые тесты оставалисьудлиненными при добавлении нормальной плазмы, то проводились тесты,подтверждающиенаправленностьциркулирующихингибиторовпротивфосфолипидов.
Для поведения подтверждающей пробы использовались лизатытромбоцитов (PNP, STAGO, France) и гексагональный фосфолипид (Staclot, Stago,France). Укорочение АЧТВ до нормы свидетельствовало об антифосфолипиднойприроде циркулирующих ингибиторов.2.2.4 Определение концентрации гомоцистеинаКонцентрациягомоцистеинаопределяласьвплазмекровииммуноферментным методом на приборе ANTOS 2020, США, с использованиемреактивов Axis® фирмы Axis-Shield AS, Норвегия. Нормальные показатели уженщин (18-90 лет) – менее 15 мкмоль/л.
При беременности нормативныепоказатели не меняются. Степени гипергомоцистеинемии: легкая степень (15-30мкмоль/л), средняя степень (31-100 мкмоль/л), тяжелая степень (>100 мкмоль/л).562.2.5 Выявление генетических форм тромбофилииМолекулярный анализ генетических дефектов гемостаза выполнялсяметодом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Основные этапы выявлениягенетических дефектов гемостаза включали: выделение ДНК; амплификацию(методом ПЦР); рестрикцию. Метод амплификации ДНК in vitro обеспечиваетвыявление даже незначительных изменений в генах. Принцип ПЦР заключается вциклической денатурации с образованием матричных цепей, гибридизацииолигонуклеотидов, комплементарных синтезируемой ДНК.Определение мутации в гене фактора V (Leiden) свертывающей системыкрови методом полимеразной цепной реакции.
Мутация Leiden в гене фактора Vпредставляет собой замену остатка аденина в положении 1691 на остаток тимина.В результате мутации происходит замена A506T в полипептидной цепи FV. Врезультате ПЦР амплифицируется участок исследуемой ДНК, измененный поддействием мутации. Мутация Leiden нарушает сайт рестрикции для рестриктазы.Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте нормальный, но немутантный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНКинкубируют с рестриктазой. При отсутствии мутации после электрофорезаобнаруживают две низкомолекулярные полосы, образовавшиеся под действиемфермента. Полная устойчивость продукта ПЦР к рестриктазе свидетельствует оналичии в анализируемой ДНК гомозиготной мутации, а частичная —гетерозиготной формы.
Продукты ПЦР обнаруживаются в 3% агарозном гелепослепрокрашиваниябромистымэтидиемпофлюоресценциивультрафиолетовом свете. При проведении ПЦР в пробах, содержащих ДНКчеловека, образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар. Инкубацияпродукта ПЦР с рестриктазой сопровождается его полным расщеплением при57отсутствии мутации Leiden. Расщепление отсутствует при наличии гомозиготнойформы, при гетерозиготной форме мутации - частичное расщепление.ОпределениемутацииС20210Авгенепротромбинаметодомполимеразной цепной реакции.
Мутация представляет собой замену остаткагуанина в положении 20210 на остаток аденина, локализованного в его концевойнекодирующей части. В результате мутации не изменяется последовательностьаминокислотполипептиднойцепипротромбина,однакоувеличиваетсястабильность его м-РНК, что сопровождается повышением уровня синтезапротромбина и его концентрации в плазме крови.
Мутация Pt G20210A нарушаетв ПЦР-продукте искусственный сайт рестрикции для рестриктазы, недостающиенуклеотиды которого вводятся в ПЦР- продукт с помощью одного из праймеров.Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте нормальный, но немутантный амплифицирoванный фрагмент ДНК.
При наличии гомозиготноймутацииисходныйпродукт ПЦРне расщепляетсяферментом. Полноерасщепление продукта ПЦР свидетельствует об отсутствии мутации Pt G20210A ванализируемой ДНК, а частичное - гетерозиготной формы мутации. ПродуктыПЦР обнаруживают в 3% агарозном геле после прокрашивания бромистымэтидием по флюоресценции в ультрафиолетовом свете. Инкубация продукта ПЦРс рестриктазой сопровождается его полным расщеплением при отсутствиимутации, частичным при наличии гетерозиготной мутации.Определение полиморфизмовметодомПЦР.Врезультатев генах ферментов фолатного цикладанныхполиморфизмовизменяетсяпоследовательность аминокислот полипептидной цепи ферментов, что делает ихтермолабильными, приводит к их дефициту и повышению уровня гомоцистеина вплазме крови из-за подавления его метаболизма.
С помощью ПЦР производитсяамплификация участка ДНК обследуемого пациента, изменяемого под действиеммутации. При этом содержание амплифицируемого фрагмента ДНК в пробеувеличивается в ~108 раз по сравнению с исходным. Процесс амплификациисовершается при повторных циклах температурной денатурации ДНК, отжига58олигонуклеотидных праймеров на комплементарных последовательностях ДНК ипоследующейдостройкеполинуклеотидныхцепейсэтихпраймеровтермостабильной ДНК-полимеразой. Мутация приводит к образованию новогосайга рестрикции для рестриктазы. Поэтому рестриктаза может расщеплять вэтом месте мутантный, но не нормальный продукт ПЦР. По окончании ПЦРобразовавшийся фрагмент ДНК инкубируют с рестриктазой и продукты реакциианализируютэлектрофорезомвагарозномгеле.Приналичиимутацииобнаруживают образование двух низкомолекулярных полос, образовавшихся поддействиемфермента.ПриэтомполноерасщеплениепродуктаПЦРсвидетельствует о наличии в анализируемой ДНК гомозиготной формы мутации,а частичное - гетерозиготной.
Продукты ПЦР становятся видимыми в 3%агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием благодаря ихфлюоресценции в ультрафиолетовом свете. В результате полимеразной цепнойреакции образуется фрагмент ДНК. Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой несопровождается его расщеплением при отсутствии мутации, полное расщеплениес образованием фрагментов ДНК нуклеотидов происходит при наличиигомозиготной формы мутации и при гетерозиготной мутации - частичноерасщепление.ВпроцессеПЦР-диагностикиполиморфизмовгеноврецепторовтромбоцитов, фибриногена, рецептора ангиотензина II типа 1, ингибитораактиватора плазминогена 1, тканевого активатора плазминогена, ангиотензинпревращающегофермента,ферментовфолатногоциклаиспользовалисьспецифические для каждой группы генов наборы рестриктаз.Функциональная значимость исследования мутаций и полиморфизмовгенов и выявления циркуляции АФА представлена в таблице 1.59Таблица 1 - Функциональная значимость исследования полиморфизмовгенов гемостаза, рецепторов тромбоцитов, ферметнов фолатного цикла ициркуляции антифосфолипидных атителПолиморфизм гена /комплекс АФАФункциональная значимость теста«G1691A» F5 фактор гемостаза(фактор Лейдена)гиперкоагуляция,устойчивость к активированному протеину С,высокий риск тромбоза«G20210A» F2 фактор гемостаза гиперкоагуляция,(протромбин)увеличение уровня протромбина,высокий риск тромбоза«G455A» FGB – β-субъединица увеличение уровня фибриногена,F1 фактор гемостазаповышение вязкости крови,(фибриногена)высокий риск тромбоза«675 4G/5G», PAI-I ингибитор повышение уровня PAI-1, снижениеактиватора плазминогена 1 типа активности фибринолитической системы,риск тромбоза, риск преэклампсии«C7351T» PLAT тканевойгипофибринолиз,активатор плазминогенанарушение превращения плазминогена вплазмин«C807T» GpIa тромбоцитарный увеличение адгезии тромбоцитов к коллагену,гликопротеин 1aриск атеротромбоза«T1565C» GpIIIaувеличение агрегации тромбоцитов,тромбоцитарный гликопротеин риск атеротромбоза3a«С434T» GpIba тромбоцитарный увеличение адгезии тромбоцитов кгликопротеин 1bафактору Виллебранда,риск атеротромбоза«I/D» ACE ангиотензинвысокий риск гипертонии, риск преэклампсии,конвертирующего ферментаустойчивость к антигипертонической терапии«1166 А/С» рецепторвысокий риск гипертонии, рискангиотензина IIпреэклампсии,устойчивость к антигипертонической терапии«C677T» MTHFRгенетический риск развитияметилентетрагидрофолатгипергомоцистеинемииредуктаз«1298А/С» MTHFRгенетический риск развитияметилентетрагидрофолатгипергомоцистеинемииредуктазы60Таблица 1 - продолжение«1958G/A» MTHFDметилентетрагидрофолатдегидрогеназы«A66G» MTRR метионинсинтазы редуктаза«A2756G» MTR метионинсинтазаАТ к кардиолипинуАТ к фосфатидилхолину,фосфатидилинозитолуАТ к протромбинуАТ к анексинуАТ к β2-гликопротеину-1Волчаночный антикоагулянтенетический риск развитиягипергомоцистеинемиигенетический риск развитиягипергомоцистеинемиигенетический риск развитиягипергомоцистеинемииповышенный протромбогенный потенциал,риск тромбозов,риск невынашивания беременности,риск тромбоцитопениистимулируют синтез фактора Виллебранда,индуцируют активность тканевого фактораэндотелиальными клетками, стимулируютпроцесс коагуляции и вызываютэндотелиопатиюнапрямую ингибируют факторы свертываниякрови, что приводит к удлинению временифосфолипидзависимых коагуляционных тестовповышенный протромбогенный потенциал,риск тромбозов,риск невынашивания беременности ивнутриутробной гибели плодаповышенный протромбогенный потенциал,риск тромбозов,риск невынашивания беременности,группа антифосфолипидных антител,относится к иммуноглобулинам класса IgG.Подавляет реакцию превращения протромбинав тромбин, проявляется удлинениемкоагулологических тестов, временисвѐртывания (АЧТВ, протромбиновый тест)612.2.6 Инструментальное обследованиеИнструментальное обследование включало ультразвуковое исследованиеплода, органов малого таза и послеродовой матки, осуществлявшиеся припомощиультразвуковогоаппарата«sonoaceх6-rus medison» (Корея) иультразвукового аппарата «aplio 500 toshiba» (Япония), с применениемтрансабдоминальноготрансвагинальногообеспечениемдляконвексногодатчика6реализациимгц,датчикас3,5мгципредустановленнымтриплексногорежимаполостногопрограммнымсканирования-серошкальный b-режим в сочетании цветового и импульсного допплера вмасштабе реального времени - «real- time processing».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
