Диссертация (1140740), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Применение стрептавидин-биотинового комплексапозволяет значительно повысить чувствительность метода ИФА (до 10-9 – 1012моль), так как при использовании конъюгата с одной молекулойисследуемого вещества можно связать десятки молекул биотина.Определение уровня ИЛ-1βв содержимом пародонтальныхкармановДля изучения содержания ИЛ-1β использовали тест-систему длятвердофазного иммуноферментного анализа BIOSOURCE (Europe S.A.,Версия G2 01/31/01 PR019, БиоХимМак).Исследуемый образец (содержимое пародонтальных карманов) вколичестве 30 мкл вносили в 30 мкл инкубационного буфера и выдерживалипри комнатной температуре 45 мин.
Затем удаляли содержимое ячеек ипромывали 4 раза. Добавляли биотинилированный конъюгат в объеме 100мклиинкубироваличетырехкратного2часапромыванияприкомнатнойдобавлялитемпературе.100 мклПослестрептавидиновогоконъюгата и спустя 30 мин. – 100 мкл хромогенного раствора. После 30минутной инкубации добавляли 100 мкл стоп-раствора и считывалиоптическую плотность при 450 нм.ОпределениеуровняИЛ-6всодержимомпародонтальныхкармановДля изучения содержания ИЛ-6 использовали тест-систему длятвердофазного иммуноферментного анализа BIOSOURCE (Europe S.A.,Версия К2 031/31/01 PR059, БиоХимМак).Исследуемый образец (содержимое пародонтальных карманов) вколичестве 50 мкл вносили в 50 мкл инкубационного буфера и выдерживалипри комнатной температуре 30 мин.
Затем удаляли содержимое ячеек ипромывали 4 раза. Добавляли биотинилированный конъюгат в объеме 10068мклиинкубироваличетырехкратного2часапромыванияприкомнатнойдобавлялитемпературе.100 мклПослестрептавидиновогоконъюгата и спустя 30 мин. - 100 мкл хромогенного раствора. После 30минутной инкубации добавляли 100 мкл стоп-раствора и считывалиоптическую плотность при 450 нм.ОпределениеуровняИЛ-4всодержимомпародонтальныхкармановДля изучения содержания ИЛ-4 использовали тест-систему длятвердофазного иммуноферментного анализа BIOSOURCE (Europe S.A.,Версия В2 01/31/01 PRO 19, БиоХимМак).Исследуемый образец (содержимое пародонтальных карманов) вколичестве 50 мкл вносили в 50 мкл инкубационного буфера и выдерживалипри комнатной температуре 2 часа. Затем удаляли содержимое ячеек ипромывали 4 раза.
Добавляли биотинилированный конъюгат в объеме 100мклиинкубироваличетырехкратного2часапромыванияприкомнатнойдобавляли100 мклтемпературе.Послестрептавидиновогоконъюгата и спустя 30 мин. - 100 мкл хромогенного раствора. После 30минутной инкубации добавляли 100 мкл стоп-раствора и считывалиоптическую плотность при 450 нм.Определение уровня ФНО-α в содержимом пародонтальныхкармановДля изучения содержания ФНО-α использовали тест-систему длятвердофазного иммуноферментного анализа BIOSOURCE (Europe S.A.,Версия С2 041/31/01 PR0219, БиоХимМак).Исследуемый образец (содержимое пародонтальных карманов) вколичестве 50 мкл вносили в 50 мкл инкубационного буфера и выдерживалипри комнатной температуре 2 часа. Затем удаляли содержимое ячеек ипромывали 4 раза. Добавляли биотинилированный конъюгат в объеме 10069мклиинкубироваличетырехкратного2часапромыванияприкомнатнойдобавлялитемпературе.100 мклПослестрептавидиновогоконъюгата и спустя 30 мин. - 100 мкл хромогенного раствора.
После 30минутной инкубации добавляли 100 мкл стоп-раствора и считывалиоптическую плотность при 450 нм.2.8. Методы статистического анализаСтатистический анализ проводили в выборках, которые получали приразделении общего массива данных по следующим критериям:1.по состоянию тканей пародонта: ХГП;2.по ИМТ ≥ 25 кг/м2;3.по полу: 1 – мужчины, 2 – женщины;4.по возрасту: 1 – 35 - 44 года, 2 – 45-54 года, 3 – 55-65 лет;5.по степени тяжести заболевания: 1 – ХГП легкой степени, 2 –ХГП средней степени, 3 – ХГП тяжелой степени;6.по глубине ПК: 1 – до 3 мм, 2 – 3–6 мм, 3 – более 6 мм;7.по кровоточивости десны: 0 – нет, 1 – есть;8.по степени подвижности зубов: 0 – нет, 1 – есть;Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетаStatistica 10.0 (StatSoft, США).В случае нормального распределения величин в выборках сравнениесредних проводили путем использования t–критерия Стьюдента (попарноесравнение) и F–критерия Фишера (сравнение средних в трех и болеегруппах).В случае нарушения нормальности распределения величин внутривыборок использовали непараметрические критерии Краскела–Уоллиса(сравнение средних в трех и более группах) и Манна–Уитни (попарноесравнение).Прианализевзаимосвязейвнутрипарыколичественныхилипорядковых качественных признаков использовали корреляционный анализ70по методу Спирмана.
Метод ранговой корреляции Спирмана позволялопределить силу и направление корреляционной связи между двумяпризнакамииликорреляционногополученныхдвумяпрофилямианализасводитсякоэффициентов(иерархиями)кпроверкекорреляции.Припризнаков.уровнярасчетеЗадачазначимостикоэффициентаранговой корреляции Спирмана не требуется никаких предположений охарактерераспределенийпризнаковвгенеральнойсовокупности,необходимо лишь располагать двумя рядами значений, которые могут бытьпроранжированы. Такими рядами значений могут быть:1) два признака, измеренные в одной и той же группе испытуемых;2) две индивидуальные иерархии признаков, выявленные у двух3) две групповые иерархии признаков;4) индивидуальная и групповая иерархии признаков.Уровень статистической значимости во всех видах статистическогоанализа был одинаковым: 95% (р≤0,05).Оценку сопряжения между признаками осуществляли с помощьюметода построения таблиц сопряженности и кросстабуляции.Силу связи между номинальными переменными оценивали с помощьюкритерия Крамера (Cramer’s V).
Критерий может принимать значения от 0 до1.Коэффициент сопряженности Пирсона Хи-квадрат с поправкой направдоподобие Мантеля-Хэнзеля позволял оценить меру взаимосвязи междупризнаками.Оценкучувствительности,специфичностиипрогностическойзначимости выявления каждого признака для тяжелого течения ХГПпроводили на основании составленной матрицы решения (табл. 5) исоответствующих формул.Таблица 5 - Макет матрицы решения для определения диагностическойчувствительности и специфичности71ПризнакОсложнениеПрисутствуетОтсутствуетЕстьabНетcdДиагностическая чувствительность (sensitivity) – это вероятностьразвития осложнения при выявлении признака. Определяли по формуле:Se=a/(a+c)100%.Диагностическаяспецифичность(specificity)–этовероятностьотсутствия признака у пациентов с осложнением. Определяли по формуле Sp=d/(b+d)100%.Дляразработкипрогностическоймоделииспользовалиметодлогистической регрессии. Логистическая регрессия используется, когдазначение переменной результата являлось бинарным (да/нет или 1/0) ивключал одну или более независимых переменных.
Логистическая регрессия– это разновидность множественной регрессии, назначение которой состоит ванализесвязимеждунесколькиминезависимымипеременными(называемыми также предикторами) и зависимой переменной. С помощьюбинарной логистической регрессии можно оценивать вероятность того, чтособытиенаступитдляконкретногоиспытуемого(например,больной/здоровый, риск высокого класса/низкого класса).Далее, исходя из значений чувствительности и специфичности, намиосуществлено построение характеристической кривой (ROC-кривая илиReceiver Operator Characteristic сurve) с помощью ROC анализа для расчетадифференциальных точек разделения или порогов отсечения (cut-off). ROCкривая показывает зависимость количества верно диагностированныхположительныхслучаевотколичестваневернодиагностированныхположительных случаев.
В терминологии ROC-анализа первые называютсяистинно положительным, вторые – ложно отрицательным множеством.72ROC-кривая получается следующим образом. Для каждого значенияпорога отсечения, которое меняется от 0 до 1 с шагом 0,01 рассчитываютсязначения чувствительности Se и специфичности Sp. Строится графикзависимости: по оси Y откладывается чувствительность Se, по оси X – 100%–Sp (доля ложно положительных случаев). Для идеального классификатораграфик ROC-кривой проходит через верхний левый угол, где доля истинноположительныхслучаевсоставляет100%или1.0(идеальнаячувствительность), а доля ложно положительных примеров равна нулю.Поэтому чем ближе кривая к верхнему левому углу, тем вышепредсказательная способность модели. Наоборот, чем меньше изгиб кривой ичем ближе она расположена к диагональной прямой, тем менее эффективнамодель.
Диагональная линия соответствует "бесполезному" классификатору,т.е. полной неразличимости двух классов. Кривая, расположенная выше илевее, свидетельствует о большей предсказательной способности модели.КлючевыммоментомROCанализаявляетсянахождениядифференциальной точки разделения (cut-off). Порог отсечения нужен длятого, чтобы применять модель на практике: относить новые примеры кодному из двух классов в зависимости от соотношения величины показателясточкойcut-off.Пороготсечениясоответствуетмаксимальнойдиагностической чувствительности и специфичности метода.Кроме того, с помощью анализа ROC – кривых проводили оценкудиагностической эффективности модели путем определения площади подROC – кривой (AUC или Area Under Curve).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
