Диссертация (1140693), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Пленки с рисунками46сканировалинафотоизображения.сканереЛХ-МВ1900(Panasonic)дляполученияС помощью программы Adobe Photoshop CS3 проводилиизмерения диметров внутри контуров раны (в 3-4 взаимно перпендикулярныхнаправлениях) и рассчитывали среднюю величину в сантиметрах.Дляпреобразования единиц измерения использовали заранее определенные спомощью объект-микрометра геометрические коэффициенты, устанавливающиесоотношение между числом пикселей изображения и физическим размеромизмеряемых объектов. После этого рассчитывали площадь раны по формулеплощади круга πD2.Статистический анализ полученных результатов выполняли при помощистандартного пакета статистических программ SPSS 20.0 for Windows.
Цельюпроведения статистического анализа были критическая оценка и интеграцияданных, полученных в 5 группах экспериментов на исследуемой выборкеотдельных животных, а такжевыявление статистических параметров данныхпланиметрии и сроков полного заживления ран в зависимости от используемоговоздействия.
Для этого проводили сравнение групп по исследуемым признакам иоценку статистической значимости различий.47ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХИССЛЕДОВАНИЙ3.1. Экспериментальная часть invitroЭкспериментальнаячасть,проводившаясяinvitro,былапроведенасовместно с Институтом физической химии им. Н.Н. Семенова. В качествеобъекта воздействия была выбрана молекула триптофана, так как она наиболееточно повторяет процесс воздействия фотосенсибилизатора с клеточнымиструктурами.Для проведения модельного эксперимента была выбран вариант водногораствора «Фотодитазина» в концентрации 2 мг/мл, который стандартноприменяется при ФДТ гнойных ран мягких тканей.По результатам исследований, проведенных ранее, было известно, чтонаиболее перспективными компонентами для создания комплексов на основе«Фотодитазина» являются плюроник F127, наночастицы золота и хитозан.Впервомэтапеэкспериментаоцениваликомплекснаоснове«Фотодитазина» и хитозана.
Двойные системы получали смешением растворов«Фотодитазина» и хитозана (в 0,3%-ной уксусной кислоте) в течение 10мин.Концентрация хитозана в двойных системах менялась от 1,2 ∙ 10-6 до 1,2 ∙ 10-2моль/л.АСМ-изображения получали на сканирующем зондовом микроскопе«SolverP47»(производствоNT-MDT,г.Зеленоград).АСМ-исследованияпроводили в полуконтактной моде в режиме топографии с использованиемкантилевера серии NSG11c жесткостью 40 Н/м и резонансной частотой 160кГц.По итогам проведенного эксперимента был получен следующий графиквзаимодействия молекулы триптофана и различных концентраций комплекса«Фотодитазин»-хитозан (рисунок 14).48kэф, л/моль с300122003100-4-3-2-1lg cпл, моль/лРисунок 14 ― График зависимости эффективной константы kэфф скоростифотоокисления триптофана (2,5∙10-4 М) в присутствии различных концентрацийкомплекса ФД-хитозанКак видно из графика, наиболее плотное воздействие на молекулутриптофана без потери эффективности и сохранении активности синглетногокислорода достигается при концентрации хитозана в комплексе «Фотодитазин» ―хитозан при концентрации около 23 мг/мл.Аналогичным образом определялось воздействие на молекулу триптофанананочастиц золота и плюроника F127 в комплексе с «Фотодитазином» ификсированных на КМЦ.
В результате была получена следующая диаграмма,которая представленная на рисунке 15.49123424002200keff,л/(моль*с)200018001600140012001000051015205С*10 ,М(в)Рисунок 15 ― Диаграмма зависимости эффективной константы kэффскорости фотоокисления триптофана (2,5∙10-4 М), в присутствии наночастицзолота, КМЦ и F127В результате построения диаграммы по итогам эксперимента быловыяснено, что оптимальной концентрацией для проведения ФДТ для наночастицзолота будет 5 ∙ 10-4 мг/мл, а для карбоксиметилцеллюлозы ― 18 мг/мл. Отдельноследует отметить, что в эксперименте использовались наночастицы золота,размерность которых варьировалась от 30 до 160 нм. По результатампроведенных ранее опытов именно данные размеры наночастиц позволялинаиболее эффективно окислять молекулу триптофана.На третьем этапе эксперимента определяли необходимую концентрациюплюроника F127 для достижения максимального окисления молекулы триптофанав реакции.
Оказалось, что при достижении определенной концентрацииплюроника в комплексе происходит падение совместимости всего комплекса кмолекуле триптофана и, как следствие, значительное снижение эффективности50молекулыфотосенсибилизатора.Распределениеконцентрацийплюроникапоказано на рисунке 16.123424002200keff,л/(моль*с)200018001600140012001000051015205C*10 ,М(г)Рисунок 16 ― Диаграмма зависимости эффективнойконстанты kэфф скорости фотоокисления триптофана (2,5∙10-4М) в присутствии F127По приведенной диаграмме можно сделать вывод, что максимальноэффективное воздействие на молекулу триптофана достигается при концентрацииплюроника F127 в районе 20 мг/мл. При повышении концентрации плюроникаF127 до 30 мг/мл, происходит лавинообразное снижение активности всегокомплекса, что, в свою очередь, делает процедуру ФДТ неэффективной.Для определения максимально эффективного варианта модернизированногокомплекса на основе «Фотодитазина» был произведен сравнительный анализактивностивоздействияразличныхвариантовкомплексанаоснове«Фотодитазина» на молекулу триптофана.Результаты эффективности были отображены на графике (рисунок 17).51kэф, л/моль с200310021-6-5-4-3-2lg cх, моль/лРисунок 17 ― График зависимости логарифма эффективной константыlnkэфф окисления триптофана (2,5∙10-4 М), катализируемого ПФС и ПФС, от 1/Т: вприсутствии ФД-F127 (1), ФД-хитозан (2), ФД-наночастицы золота, F127,КМЦ (3)Исходя из графика, можно сделать вывод о том, что комплекс«Фотодитазин», плюроник F127, КМЦ и наночастицы золота наиболееэффективно воздействуют на молекулу триптофана и дольше сохраняют своюфотохимическую активность.
Два других комплекса обладают более низкойэффективностьювоздействиянамолекулутриптофана,однакочерезнезначительный промежуток времени все три варианта модифицированныхкомплексов достигают практически одинаковых значений по воздействию намолекулу триптофана. Это позволяет предположить, значительное сродство вконечном лечебном результате.На основании вышеописанной части эксперимента было принято решение онеобходимости проведения клинических испытаний всех трех вариантовмодификаций комплекса на основе «Фотодитазина».3.2. Экспериментальная часть invivoВ 1-й серии экспериментов целью исследований явилось сравнениерезультатов влияния фотосенсибилизирующих средств («Фотодитазина» в форме52водногораствора,«Фотодитазина»сплюроникомF127;комплекса«Фотодитазин» ― хитозан; «Фотодитазин», плюроник F127 и наночастицызолота), применяемых в методике ФДТ, на микробную обсемененностьэкспериментальных гнойных ран.3.2.1.
Результаты бактериологического исследованияОдним из основных и значимых критериев оценки эффективностипроведенного лечения гнойных ран мягких тканей является микробиологическоеисследование.Цельюданногоисследованиябылоопределениевидовойпринадлежности возбудителя инфекции, количество микробных тел до и послеобработки на всех этапах проводимого лечения, а также чувствительностибактерий к различным вариантам фотосенсибилизаторов в зависимости о ихпринадлежности к грамположительной или грамотрицательной микрофлоре.Чувствительностьразличныхштаммовкантибактериальнойтерапиинепроводилось, с целью выявления достоверности исследования при применениифотосенсибилизатороввкачествеосновногокомпоненталеченияэкспериментальных гнойных ран мягких тканей.При первичном изучении микробной обсемененности крыс в каждойэкспериментальной группе было установлено, что концентрация Staphylococcusaureus в среднем составила 3,25 + 0,05∙106Е а Escherichia coli и Pseudomonasaeruginosa 4,20 + 0,05∙106Е.Измерение микробной обсемененности производилосьдважды на каждом этапе эксперимента.
Определение микробной обсемененностипроизводилось до начала лечения, сразу после проведения первого сеанса ФДТ,перед проведением второго и после второго сеанса. Количественные показателимикробной обсеменённости ранрезультаты представлены на рисунке 18 (А, Б) и втаблице 2.53ААББРисунок 18 (А, Б)― Диаграмма изменения бактериальной обсеменённостиран в процессе лечения:А – влияние ФДТ на грамположительную микрофлоруБ– влияние на грамотрицательную микрофлоруПримечание:Группа I (контрольная) – Обработка ран раствором хлоргексидина.Группа II – Водный раствор «Фотодитазина» + ФД-активация.Группа III – Комплекс «Фотодитазин» ― плюроникF127 + ФД-активация.Группа IV – Комплекс «“Фотодитазин”» ―плюроник ― Au ― КМЦ» +ФД-активация/Группа V – Комплекс «Фотодитазин» ― хитозан + ФД-активация/54Через 24 часа после инфицирования перед 1-м сеансом ФДТ инициальнаяконтаминация ран во всех группах животных была одинаковой и составила длякокковой флоры: 3,00±0,05Е∙106– 3,80±0,05Е∙106 и для грамотрицательныхпалочек: 2,80±0,05Е∙106 – 5,00±0,05Е∙106(таблица 2).В контрольной группе первичная обработка ран раствором хлоргексидинапривела к уменьшению числа грамотрицательных палочек до4,20±0,05Е∙104(рисунок 18, Б), но не повлияла на присутствие стафилококков (рисунок 18, А).Повторная обработка ран хлоргексидином также не привела к снижению уровняобсеменённости как кокковой, так и палочковой флоры по сравнению с исходным(до начала 2-й обработки) уровнем.
Следует отметить уровень летальности в этойгруппе – 33,3%.Вовсехопытныхгруппахпосле1-госеансаФДТприсутствиестафилококков уменьшилось в 1,5-2 раза. То же можно видеть и в отношенииграмотрицательных палочек,кроме показателей в III группе, где в качествефотосенсибилизатора использован комплекс «Фотодитазина» с плюроником. Впосевах из ран в этом случаечисло проросших колоний было меньше 10бактерий/мл (<1,0E∙10Е). Обращает на себя внимание, что эта закономерностьнаблюдалась и после 2-го сеанса ФДТ с комплексом «“Фотодитазин” ―плюроник»,чтопозволяетговоритьобизбирательностиэтоговидафотохимического воздействия в отношении грамотрицательной флоры.
Данноенаблюдение в некоторой степени согласуется с результатами проведенных ранееисследований, показавших, что использование системы ФД-АП-ГА при леченииинфицированных ран у крыс оказалось эффективнее обычно используемых приФДТ гнойных ран фотосенсибилизаторов– холосенса и «Фотодитазина»[96].Ввыполненныхнамиэкспериментахinvitroтакжеобнаруженаизбирательная антимикробная активность комплексов «Фотодитазин»–хитозан вотношении грамотрицательных бактерий.Все особенности такой избирательностипока неясны, но, возможно, что наблюдавшаяся в ранее проведенныхэкспериментах высокая антимикробная фотоактивность комплексов ФД-АП при55терапии гнойных ран достигается вследствие специфического связываниягидрофобных группировок АП с фрагментами клеточных стенок бактерий [70-71].При сравнении уровня общей обсемененности ранкритерия Стьюдента к логарифмированнымс помощью парногозначениям КОЕ/мл (lg КОЕ/мл) споследующей поправкой Холма-Бонферрони былополучено достоверноеснижение бактериальной обсемененности ран в группе V, где в качествефотосенсибилизатора использовали комплекс «“Фотодитазин” ― плюроник ―хитозан».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
