Диссертация (1140693), страница 6
Текст из файла (страница 6)
По верхнему срезу цилиндрической части кольцафиксировали целлофановую пленку для предотвращения высыхания раны ивнешнего загрязнения(рисунок 9).Рисунок 7 ― Тефлоновые кольца для ограничения площади ранРисунок 8 ― Внесение микробной взвеси в мягкие ткани дна раны37Рисунок 9 ― Общий вид сформированной модели полнослойнойплоскостной раны кожиВ связи с тем что в наших исследованиях предстояло изучитьантибактериальнуюэффективностьмодифицированногокомплекса«Фотодитазин» дляФДТ в отношении гноеродной флоры различной групповойпринадлежности, мы для инфицирования ран использовали взвесь суточнойассоциированной микробной культуры, содержащую 1 млрд микробных тел в 1мл.
В ассоциации в равновесном соотношении содержались патогенныевозбудители разной групповой принадлежности: грамположительные бактерии –Staphylococcus aureus S7 (клиническийштамм); грамотрицательные палочки – Escherichia coli ATCC 8739 (стандартныйштамм, используемый для тестирования антимикробной активности) Pseudomonas aeruginosa (1 мл взвеси – 108 КОЕ)Ход экспериментаВ зависимости от вида обработки, используемой для лечения ран,выполнено пять групп экспериментов по 6 животных в каждой (таблица 1).38Таблица 1 ― Экспериментальные группы животных№ группыАкронимВид воздействияI (контрольная)ChxОбработка ран раствором хлоргексидинаIIFLВодный раствор «Фотодитазина» + ФДактивацияIIIКомплекс «”Фотодитазин“ ― -C:FPLLплюроник» + ФД-активацияIVКомплекс «”Фотодитазин“ ― плюроникC:FPLAuL― КМЦ ― Au» + ФД-активацияVКомплекс «”Фотодитазин“ ―-хитозан» +C:FPLChiLФД-активацияЧерез сутки после нанесения раны и её инфицирования в опытных группах(II-V) начинали сеансы ФДТ.Методика и порядок проведения ФДТЖивотных наркотизировали в/м введением 150 мкл смеси растворовзолетила и рометара в расчетных концентрациях.С поверхности кольца снимали защитную пленку.
Если в полости кольцаприсутствовал экссудат, его удаляли стерильным тампоном,после чего нараневуюповерхностьнаносилирастворилигельизучаемогофотосенсибилизатора в количестве 1,5 мл:1) водный раствор препарата «Фотодитазин»;2) комплекс «Фотодитазин» с плюроником F127;3) комплекс «Фотодитазин» с плюроником F127 и наночастицами золота(1,8%) и КМЦ;4) комплекс «Фотодитазин» и хитозаном (2,7%).39После аппликации фотосенсибилизатора раневуюповерхност накрывалисалфеткой и животных помещали в темный бокс.Через 15 мин начиналифотообработку ран.Сеансы ФДТ ран проводили, используя в качестве источника излученияполупроводниковый лазер с длиной волны излучения 661 нм и выходноймощностью 0,1-2 Вт. В данном исследовании был использован лазерный аппарат«АТКУС-2» (ЗАО «Полупроводниковые приборы», г. Санкт-Петербург): длинаволны излучения 661 нм, выходная мощность 0,1-2 Вт (рисунок 10).
Аппаратразрешен к применению в медицине. Сертификат соответствия: Госстандарт РФ№ РОСС Ru, ИМ15 В00404, № 6053691.Контроль выходной мощности осуществляли путем измерения мощности навыходном конце световода с помощью интегрального измерителя мощностиИИМ-1П (Научно-производственная фирма «ПОЛИРОНИК», Россия) (рисунок11).Дно раны с расстояния 1-2 см от поверхности облучали расфокусированнымлучом (диаметр пятна облучения ≈ 0,5-0,8 см, с плотностью мощности 1 Вт/см2)сканирующими круговыми перемещениями световода в течение 1 мин (рисунок12). Плотность энергии составляла 30 Дж/см2.Рисунок 10 ― Полупроводниковый лазерный аппарат «АТКУС-2» снасадками для проведения ФДТ40Рисунок11 ― Внешний вид аппарата интегрального измерителя мощности(ИИМ-1П)Рисунок 12 ― «Засветка» раныПосле окончания облучения поверхность кольца снова укрывали пленкой.Процедуру повторяли на третьи сутки после нанесения раны.На 4-е сутки после нанесения раневого дефекта и его инфицирования(следующие сутки после последнего сеанса ФДТ) животных выводили изэксперимента внутрибрюшинным введением 2,0 мл 25% раствора сернокислоймагнезии.
Тефлоновые ограничительные кольца удаляли из ран и полностьюиссекали ткань, заполняющую рану на всю глубину до собственной фасции, безкожи(рисунок13).Изъятыйгистологического изучения.биоптатнаправлялидлядальнейшего41Рисунок 13 ― Иссечение тканей раны для патоморфологическогоисследованияМетодика гистологических исследованийИзъятый материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального(забуференного) формалина. После трех суток фиксации из биоптата (вдольдиаметра от края до края иссечённого пласта ткани) вырезали полоску щириной ≈0,5-0,6 см и заливали в парафиновые блоки по стандартной методике.Парафиновые срезы 4-5 микрон окрашивали гематоксилином и эозином,пикрофуксиномпоВан-Гизону(длявыявленияколлагеновыхволокон).Полученные микропрепараты изучали с использованием светового микроскопаOlympusBX51 (Olympus, Япония), оснащенного цифровой видеокамерой SDU-252(«Спецтелетехника», Россия). Изображения, полученные с помощью камеры,сохраняли в формате Tiff (16 bit).При просмотре микропрепаратов получали изображения не менее 5 полейзрения в каждом препарате.
Затем с помощью программы Adobe Photoshop CS3проводили измерения толщины слоя грануляционной ткани в нескольких точках вкаждом из полей зрения. Для преобразования единиц измерения использовализаранееопределенныеспомощьюобъект-микрометрагеометрическиекоэффициенты, устанавливающие для каждого из объективов микроскопа42соотношение между числом пикселей изображения и физическим размеромизмеряемых объектов. Полученные данные обрабатывали статистически.Методы статистической обработкиСтатистический анализ проводили с использованием стандартного пакетапрограммSPSSforWindows 13.0. Анализировали частоту встречаемости оценокпризнаков у животных разных групп с использованием таблиц сопряженности. Взависимости от формы таблиц сопряженности, а также распределения значенийпо полям таблиц для оценки наличия связи между режимом воздействия ивыраженностью морфологических признаков использовали критерии хи-квадратПирсона, V Крамера.
Корреляционные связи анализировали с применениемкоэффициентакорреляцииПирсона(Rs).Сравнениевыраженностиморфологических признаков у животных разных групп проводили с помощьюнепараметрических тестов для нескольких независимых выборок (тест КраскелаУоллиса, KW) и путем попарного сравнения групп (тест Манна-Уитни, MW) приусловии выявления существования статистически значимых различий на этапегруппового сравнения (KW). Уровень значимости различий pбыл принят равным0,05. Во всех случаях использовали двусторонние тесты.Исследования выполнены под руководством проф.А.Б.Шехтера на базелаборатории экспериментальной медицины НИИ молекулярной медициныПервого МГМУ им.И.М.Сеченова.2.4.
Микробиологическое исследованиеМикробиологическое исследование имело целью установить степеньлокальнойантибактериальнойактивностиФДТфотосенсибилизаторами в отношении раневой микрофлоры.сразличными43Исследования проводили в дни сеансов ФДТ (на 1-е и 3-и сутки посленанесения и инфицирования раны). Перед проведением засветки из каждой раныбыли взяты мазки с целью определения инициальной микробной обсемененности.Порядок проведения исследованияКоличественный бактериальный контроль проводили при помощи методаЕ.D. Rotheram.Кожу вокруг раны, выступающие бортики ограничительногокольца и покрывающую его защитную пленку обрабатывали тампоном,смоченным 70%-ным этиловым спиртом или другим антисептиком.
Послевысыхания дезинфектанта с поверхности кольца снимали защитную пленку. Еслив полости кольца присутствовал экссудат, раневой детри, их избыток удалялистерильным марлевым тампоном. После этого на раневую поверхность внутрикольца стерильным инструментом помещали стерильную марлевую салфеткуразмером 1,0×1,0 см, слегка прижимая её ко дну раны. Салфетку, пропитаннуюраневымотделяемым,соблюдаястерильность,помещаливпробирку,содержащую 1,0 мл стерильного физиологического раствора. Смыв с тампона вразведениях в 1:100 и 1:1000 (по 0,1 мл) засевали на плотную питательную средуBrainHeartInfusionAgar (Himedia) без добавок.
Чашки с посевами выдерживали втермостат при температуре 37°С в течение48 часов, после чего проводилиподсчёт проросших колоний микроорганизмов.Количественно фактическую бактериальную обсеменённость (с учётомразведений и объёма высеваемого смыва) оценивали числом колониеобразующихединиц в 1,0 мл смыва – КОЕ/мл. Статистическую обработку параметрическихданныхпроводилиспомощьюпарногокритерияСтьюдентаклогарифмированным значениям КОЕ/мл, с последующей поправкой ХолмаБонферрони.Колонии разных морфологических типов исследовали с помощью световоймикроскопии мазков, окрашенных по Граму. Идентификацию микроорганизмов,44отсутствовавших в изначальной смеси бактерий, используемых для получениямодели инфицированной раны, проводили, используя время-пролетную массспектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией наприборе Vitek MS (bioMerieux).С целью изучения реактивного влияния ФДТ и отдельных из изучаемыхфотосенсибилизаторов (в частности, комплекса ««Фотодитазин»-плюроник снаночастицами золота) на раневую микрофлору материал для посевов отбиралиперед засветкой до аппликации фотосенсибилизатора и сразу после засветки.
А вгруппе IV, где использован комплекс «“Фотодитазин”-плюроник с наночастицамизолота», посевы отбирали перед аппликацией, через 15 мин экспозиции комплексана ране (для выявления антибактериальной активности самого комплекса) и сразупосле засветки.ИсследованияпроводилинакафедремикробиологииРГМУим.Н.И.Пирогова.2.5. 3-я серия экспериментов – сравнительное изучение динамикизаживления гнойных ран при местной ФДТ с использованием комплексов«Фотодитазина» с плюроником F127, в сочетании комплекса с плюроникомF127, наночастицами золота и КМЦ, с хитозаномВ этой серии на модели плоскостной инфицированной раны кожи такжевыполнено 5 групп экспериментов на 75 белых лабораторных крысах-самцах смассой тела 120 – 140 г., полученных из питомника экспериментальных животныхНаучного центра биомедицинских технологий РАМН (филиал «Столбовая»).Алгоритм исследования: экспериментальная модель, порядок проведения иметодика ФДТ аналогичны 2-й серии экспериментов, но с тем отличием, что вданной серии на 4-е сутки после операции (после 2 сеансов ФДТ) животных изэксперимента не выводили, а оставляли на выживание и для дальнейшегонаблюдения.45На 4-е сутки после нанесения раны и её инфицирования (следующие суткипосле последнего облучения) фиксирующие кольца из ран удаляли.
Дальнейшеезаживление ран шло под струпом.ДляоценкивлиянияфотосенсибилизаторамивФДТкомплексессразличнымиамфифильнымипорфириновымиполимераминазаживление плоскостных полнослойных инфицированных ран кожи проводилидинамическое клиническое наблюдение за общим состоянием животных, заместным течением раневого процесса и за ходом заживления: перифокальныеизменения, особенности струпа, наличие и характер экссудата, развитиегрануляционной ткани и краевой эпителизации. Фиксировали сроки полногоочищения ран, отторжения первичного струпа и сроки полного заживления(эпителизации) ран.Рассчитывали индекс ускорения заживления по формулеТ0 - Т1Т=_________________× 100%,Т0где Т0― время заживления ран контрольной группы;Т1― время заживления в группе с ФДТ.Проводили планиметрию (измерение площади) раны в динамике.Методика планиметрических исследованийОдним изобъективных критериев оценки течения раневого процесса изаживления является сокращение площади ран.На 10, 14, 17-е сутки после снятия кольца (14, 18, 21-е сутки после операциинанесения раны)измеряли площадь ран, обводя их контуры на плотномпрозрачном материале (отмытая рентгеновская плёнка).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
