Диссертация (1140693), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Самыми перспективными являются фотосенсибилизаторы наоснове солей хлорина Е6.По мнению профессора П.И.Толстых, несмотря на значительные успехи вприменении ФДТ для лечения гнойных процессов, ее общая антибактериальнаяактивность является недостаточной.В настоящее время ведется активный поиск новых препаратов для ФДТгнойныхран.Порезультатампроведенныхранееисследованийбылоустановлено, что наиболее перспективным может оказаться использование85фотосенсибилизатора «Фотодитазин» в виде комплексов с низкотоксичнымиамфифильными полимерами, плюрониками или наночастицами.Новые комплексы не подвергались подробному изучению до настоящеговремени.Для исследования этих перспективных препаратов проведена даннаяработа.Цель исследования: в условиях эксперимента сравнить влияние на течениераневого процесса и бактериальную флору препарата «Фотодитазин» и новыхкомплексов на основе водного раствора препарата «Фотодитазин»; произвестиизучениеэффективностиновыхкомплексовнаоснове«Фотодитазина»,применяемых при ФДТгнойных ран мягких тканей; разработать новую методикупроведения ФДТ гнойных ран мягких тканей.Для решения поставленной задачи были проведены экспериментальныеисследования.Эксперимент был разделен на два этапа: invitro и invivo.Задачей первой части эксперимента было определениеподходящих комплексовнаиболеедля проведения модернизации водного раствора«Фотодитазина».Поитогамэкспериментаinvitroбылодоказано,чтонаиболееперспективными для дальнейшего исследования являются комплексы: комплекс «Фотодитазин» с плюроником F127; комплекс «Фотодитазин» ― хитозан; комплекс «Фотодитазин»,плюроник F127, КМЦ и наночастицамизолота;Также в ходе первой части эксперимента были определены оптимальныеконцентрации фотосенсибилизаторов, позволяющиедостичь максимальнойэффективности ФДТ.Вторая часть эксперимента проводилась invivo.
Экспериментальныеисследования модели гнойной раны выполнены на 105 беспородных крысах-86самцах в возрасте 2,5-3 месяца со средней массой тела 250 ± 20 г.Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с принципамиЕвропейской конвенции (Страсбург, 1986 г.) и Хельсинкской декларацииВсемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (2000г.), требованиями приказа №267 МЗ РФ от 19.06.2003 «Правила по обращению,содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных».Все животные содержались в одинаковых условиях виварного режима, прошликарантинный отбор и были разделены на две серии экспериментов.В первой серии опытов изучали антимикробную эффективность местногоиспользования метода ФДТ с комплексом «Фотодитазин»– плюроникF127;комплекс «Фотодитазин»― хитозан; «Фотодитазин»― плюроник F127, КМЦ инаночастицы золота.Сравнение проводилось с контрольной группой, у которойпроводилось стандартное лечение ФДТ с «Фотодитазином».В данной части эксперимента было использованы 30 крыс (n= 30), которые,в свою очередь, были разделены на пять групп в зависимости от вариантапроизводимого лечения.
В каждой группе было по 6 крыс. В ходе экспериментагнойные раны животных промывали растворами антисептиков и затемнакладывали салфетку, смоченную раствором фотосенсибилизатора, исходя изпринадлежности к экспериментальной группе(в контрольной группе ―смоченную в растворе хлоргексидина). В группе с традиционной ФДТ через 60минут от момента нанесения препарата производилизасветку раневойповерхности. Для других комплексов время экспозиции было выбрано с учетомпроведенного лабораторного эксперимента на молекуле триптофана и составляло45 минут.
Повторную процедуру нанесения препаратов и засветки производилина третьи сутки с момента первой обработки раны ФДТ ран.В данной серии опытов изучали микробную обсемененность раны вдинамике, до и после воздействия ФДТ на рану. Для оценки использовалисьмикробиологический, морфологический и гистологический методы оценки.87Микробиологическое исследование ставило перед собой задачуопределитьстепеньлокальнойантибактериальнойактивностиФДТсразличнымифотосенсибилизаторами в отношениираневой микрофлоры.Исследования проводили в дни сеансов ФДТ (на 1-е и 3-и сутки посленанесения и инфицирования раны). Перед проведением засветки из каждой раныбыли взяты мазки с целью определения инициальной микробной обсемененности.Количественный бактериальный контроль проводили при помощи методаЕ.D. Rotheram.Кожу вокруг раны, выступающие бортики ограничительногокольца и покрывающую его защитную пленку, обрабатывали тампоном,смоченным 70%-ным этиловым спиртом или другим антисептиком.
Послевысыхания дезинфектанта с поверхности кольца снимали защитную пленку. Еслив полости кольца присутствовал экссудат, раневой детрит, их избыток удалялистерильным марлевым тампоном. После этого на раневую поверхность внутрикольца стерильным инструментом помещали стерильную марлевую салфеткуразмером 1,0×1,0 см, слегка прижимая её ко дну раны. Салфетку, пропитаннуюраневымотделяемым,соблюдаястерильность,помещаливпробирку,содержащую 1,0 мл стерильного физиологического раствора.
Смыв с тампона вразведениях в 1:100 и 1:1000 (по 0,1 мл) засевали на плотную питательную средуBrainHeartInfusionAgar (Himedia) без добавок. Чашки с посевами выдерживали втермостате при температуре 37°С в течение 48 часов, после чего проводилиподсчёт проросших колоний микроорганизмов.Количественно фактическую бактериальную обсеменённость (с учётомразведений и объёма высеваемого смыва) оценивали числом колониеобразующихединиц в 1,0 мл смыва – КОЕ/мл.Колонии разных морфологических типов исследовали с помощью световоймикроскопии мазков, окрашенных по Граму.
Идентификацию микроорганизмов,отсутствовавших в изначальной смеси бактерий, используемых для получениямодели инфицированной раны, проводили, используя время-пролетную массспектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией наприборе Vitek MS (bioMerieux).88Поитогампроведенногомикробиологическогоисследованиябылодостоверно установлено снижение бактериальной нагрузки в ране до уровня<1,0±0,05E∙10 КОЕ/мл для грамотрицательной и до уровня 1,30±0,05Е∙102КОЕ/мл для грамположительной микрофлоры.На втором этапе экспериментаinvivo производили оценку влияния ФДТ наскорость заживления экспериментальных гнойных ран.Все крысы (n=75) были также разбиты на четыре опытные и однуконтрольную группы.
В каждой группе было по 15 крыс. Для леченияэкспериментальных гнойных ран применялась методика, описанная в первойсерииопыта.Макроскопическуюоценкутеченияраневогопроцессауэкспериментальных животных производили с учетом продолжительности ивыраженности воспалительных явлений в области раны (отек, гиперемия,инфильтрация окружающих тканей, количество и характер гнойного отделяемого,сроки появления грануляций, состояние дна и стенок раны, эпителизации, срокиотторжения струпа и полного заживления).В данной серии опытов использовалиметод клинических и динамических наблюдений.Изъятый материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального(забуференного) формалина. После 3 суток фиксации из биоптата (вдоль диаметраот края до края иссечённого пласта ткани) вырезали полоску шириной ≈ 0,5-0,6см и заливали в парафиновые блоки по стандартной методике.
Парафиновыесрезы 4-5 микрон окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином поВан-Гизону (для выявления коллагеновых волокон). Полученные микропрепаратыизучали с использованием светового микроскопа OlympusBX51 (Olympus,Япония), оснащенного цифровой видеокамерой SDU-252 («Спецтелетехника»,Россия).
Изображения, полученные с помощью камеры, сохраняли в формате Tiff(16 bit).При просмотре микропрепаратов получали изображения не менее 5 полейзрения в каждом препарате. Затем с помощью программы Adobe Photoshop CS3проводили измерения толщины слоя грануляционной ткани в нескольких точках вкаждом из полей зрения. Для преобразования единиц измерения использовали89заранееопределенныеспомощьюобъект-микрометрагеометрическиекоэффициенты, устанавливающие для каждого из объективов микроскопасоотношение между числом пикселей изображения и физическим размеромизмеряемых объектов.
Полученные данные обрабатывали статистически.Статистический анализ проводили с использованием стандартного пакетапрограмм SPSSforWindows 20.0. Анализировали частоту встречаемости признакови вносили их в таблицу сопряженности. В зависимости от формы таблицсопряженности, а также распределения значений по полям таблиц для оценкиналичия связи между режимом воздействия и выраженностью морфологическихпризнаков использовали критерии хи-квадрат Пирсона. Корреляционные связианализировали с применением коэффициента корреляции Пирсона (Rs).Сравнение выраженности морфологических признаков у животных разныхгрупп проводили с помощью непараметрических тестов для несколькихнезависимых выборок (тест Краскела-Уоллиса, KW) и путем попарного сравнениягрупп (тест Манна-Уитни, MW), при условии выявления существованиястатистически значимых различий на этапе группового сравнения (KW).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
