Диссертация (1140686), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Внесение образца;2. Лизис материала и сорбция ДНК;3. Отмывка сорбента от ингибиторов;4. Элюция ДНК.В пробирку объемом 2 мл вносилось 100 мкл образца. Затем в пробиркувносилось 300 мкл лизирующего раствора, содержимое перемешивалось навстряхивателе для микропробирок, подогревалось в термостате при 65о поЦельсию в течение 5 минут, краткосрочно центрифугировалось на центрифугедля микропробирок для сбрасывания капель с крышки пробирки.
В пробиркудобавлялось 30 мкл сорбента, содержимое перемешивалось на встряхивателе длямикропробирок, оставлялось на 2 минуты в штативе, после чего сноваперемешивалось на встряхивателе для микропробирок и оставлялось на 2 минутыв штативе. Затем проводилось центрифугирование пробирки при скорости 5тысяч оборотов в течение 30 секунд, надосадочная жидкость удалялась спомощью вакуумного отсасывателя. К осадку добавлялось 300 мкл отмывочногораствора 1 и перемешивалось на встряхивателе для микропробирок.
Затемпроводилось центрифугирование пробирки при скорости 5 тысяч оборотов втечение 30 секунд, надосадочная жидкость удалялась с помощью вакуумногоотсасывателя. К осадку добавлялось 500 мкл отмывочного раствора 2 иперемешивалось на встряхивателе для микропробирок. Затем проводилосьцентрифугирование пробирки при скорости 5 тысяч оборотов в течение 30секунд, надосадочная жидкость удалялась с помощью вакуумного отсасывателя.К осадку повторнодобавлялось 500мкл отмывочногораствора 2 иперемешивалось на встряхивателе для микропробирок. Затем проводилосьцентрифугирование пробирки при скорости 5 тысяч оборотов в течение 30секунд, надосадочная жидкость удалялась с помощью вакуумного отсасывателя.59Затем сорбент подсушивался в термостате при 65о по Цельсию в течение 15минут.
К осадку добавлялось 100 мкл элюирующего раствора, содержимоеперемешивалосьнавстряхивателедлямикропробирок,подогревалосьвтермостате при 65о по Цельсию в течение 5 минут, центрифугировалось при 13тысячах оборотов в течение 2 минут. Надосадочная жидкость, содержащая ДНК,переносилась в чистую пробирку.ДляопределенияполиморфизмовCYP2C19*2(G681A,rs4244285),CYP2C19*3 (G636A, rs4986893), CYP2C19*17 (C-806T, rs12248560) и ABCB1(C3435T, rs1045642) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекциейрезультатовврежимереального времениприменялсянаборреагентов«ФармакоГенетика Клопидогрел» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) надетектирующем амплификаторе DTlite (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Всостав набора входили четыре смеси для амплификации (ABCB1: 3435C>T,CYP2C19: 681G>A *2, CYP2C19: 636G>A *3, CYP2C19: -806C>T *17), ПЦРбуфер, Taq-АТ полимераза и минеральное масло.Набор подразумевает одновременную детекцию, а именно в одной пробиркеопределяются два аллельных варианта каждого генетического полиморфизма. Дляопределения четырех генетических полиморфизмов у одного пациента требуетсяподготовитьчетырепробиркидляамплификации,содержащиесмеськомпонентов для амплификации и образцы выделенной ДНК данного пациента.Пробирки со смесью для амплификации, ПЦР-буфером и Taq-АТполимеразой перемешивались на встряхивателе для микропробирок в течение 5секунд, затем центрифугировались в течение 3 секунд на центрифуге длямикропробирок.Впромаркированныепробиркивносилосьпо20мклсоответствующей смеси для амплификации отдельным наконечником длякаждого полиморфизма.
В отдельной пробирке готовилась смесь из ПЦР-буфераи Taq-АТ полимеразы в соотношении 10 мкл ПЦР-буфера на 0,5 мкл Taq-АТполимеразы с учетом количества анализируемых образцов, содержимое пробиркиперемешивалось на встряхивателе для микропробирок в течение 5 секунд, затемцентрифугировалось в течение 3 секунд на центрифуге для микропробирок. В60каждую пробирку со смесью для амплификации добавлялось по 10 мкл смеси изПЦР-буфера и Taq-АТ полимеразы. Затем в каждую пробирку добавлялось по 20мкл минерального масла, крышки пробирок закрывались для предотвращенияконтаминации.В пробирки вносилось по 5 мкл жидкости, содержащей ДНК, смесьцентрифугировалась в течение 3 секунд на центрифуге для микропробирок.
Впробиркуотрицательногоконтрольногообразца,контролявносилосьпрошедшегоэтап5мклвыделенияотрицательногоДНК,смесьцентрифугировалась в течение 3 секунд на центрифуге для микропробирок.Все пробирки устанавливались в блок детектирующего амплификатораDTlite, запускалось программное обеспечение, указывалось количество иидентификаторы образцов, в том числе отрицательных контролей, отмечалосьрасположение пробирок на матрице термоблока в соответствии с их установкой,проводилась полимеразная цепная реакция. ПЦР проводилось программнымобеспечением автоматически.
Программа амплификации для всех полиморфизмоввключала: начальную денатурацию в течение 3 минут при температуре 95о поЦельсию, последующая денатурация в течение 15 секунд при температуре 95о поЦельсию с повторением 40 циклов, отжиг в течение 40 секунд при температуре63о по Цельсию, регистрацию и учет результатов.Использование двух флуоресцентных зондов, меченных флуоресцентнымикрасителями FAM и HEX соответственно, позволяет определить соотношениеэкспрессии полиморфизма гена к «дикому» гену в одной реакционной смеси дляодной и той же пробы. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителяпроисходит в определенном для него диапазоне – канале. Каналы детекцииаллельных вариантов и интерпретация генотипов представлены в Таблицах 2.13,2.14.61Таблица 2.13Каналы детекции аллельных вариантов ABCB1 и CYP2C19Название смеси для амплификацииFAMHEXABCB1: 3435C>TTCCYP2C19: 681 G>A *2GACYP2C19: 636 G>A *3GACYP2C19: -806C>T *17CTПримечание: адаптировано из инструкции по применению набора реагентовФармакоГенетика Клопидогрел ООО «ДНК-Технология»Таблица 2.14Интерпретация генотипов ABCB1 и CYP2C19ПолиморфизмГомозиготаГомозиготаГетерозиготаFAM/ FAMHEX/ HEXFAM/ HEXABCB1: 3435C>TTTCCCTCYP2C19: 681 G>A *2GGAAGACYP2C19: 636 G>A *3GGAAGACYP2C19: -806C>T *17CCTTCTПримечание: адаптировано из инструкции по применению набора реагентовФармакоГенетика Клопидогрел ООО «ДНК-Технология»Таким образом, в результате проведенного исследования для каждогопациента составлялось заключение по генотипу ABCB1 и CYP2C19.
По ABCB1(C3435T, rs1045642) генотипирование позволяет дать одно из трёх заключений:«нормальная» гомозигота с генотипом CC, гетерозигота с полиморфизмом сгенотипом CT, гомозигота по полиморфизму с генотипом TT. По CYP2C19заключение по трём точкам CYP2C19*2 (G681A, rs4244285), CYP2C19*3 (G636A,rs4986893), CYP2C19*17 (C-806T, rs12248560) обычно представлено одним изнижеуказанных вариантов (Таблица 2.15).62Таблица 2.15Интерпретация результатов фармакогенетического тестирования поCYP2C19Генотип CYP2C19CYP2C19*2CYP2C19*3CYP2C19*17(G681A)(G636A)(C-806T)GGGGCCCYP2C19*1/*1GGGGСТCYP2C19*1/*17GGGGTTCYP2C19*17/*17GAGGСТCYP2C19*2/*17GAGGCCCYP2C19*1/*2AAGGCCCYP2C19*2/*2GGGACTCYP2C19*3/*17GGGACCCYP2C19*1/*3GAGACCCYP2C19*2/*3GGAACCCYP2C19*3/*3По скорости метаболизма ингибиторов протонной помпы пациенты сизвестным генотипом по CYP2C19 могут быть отнесены к нормальным, быстрым,промежуточнымилимедленнымметаболизаторамвсоответствиисклассификацией Голландской рабочей группы по фармакогенетике КоролевскойГолландской ассоциации клинических фармацевтов (Dutch PharmacogeneticsWorking Group Guideline of the Royal Dutch Pharmacists Association) [Swen J.J.
etal., 2011] (Таблица 2.16).Таблица 2.16Классификация носителей генотипов CYP2C19 по скорости метаболизмаИППФенотип по CYP2C19Генотип по CYP2C19Нормальные метаболизаторыCYP2C19*1/*163CYP2C19*1/*2Промежуточные метаболизаторыCYP2C19*2/*17CYP2C19*1/*3CYP2C19*3/*17CYP2C19*2/*2Медленные метаболизаторыCYP2C19*3/*3CYP2C19*2/*3Быстрые метаболизаторыCYP2C19*1/*17CYP2C19*17/*172.5 Фенотипирование CYP2C19 в моче методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии с масс-спектрометриейЗабор мочи у 59 пациентов осуществлялся утром между 8 и 9 часами утрапосле трёх дней приема омепразола дважды в день непосредственно передочередным приемом препарата натощак на четвертый день приёма либо болеепоздний день лечения.
Пробы мочи объемом 10,5 мл от 59 пациентов отбиралисьиз контейнера для сбора мочи в пластиковые пробирки RusTech (ООО "МКРУСТЕК", Россия) без реагентов и замораживались при температуре -70о поЦельсию до проведения анализа.Точка забора мочи была выбрана эмпирически в связи с достижением пятипериодов полувыведения омепразола и вероятным достижением равновеснойконцентрации препарата у пациентов в крови. У части пациентов сбор мочипроводился позже, на 5-15 день приёма омепразола, опираясь на допущение отом, что после достижения равновесной концентрации омепразола в крови еговыведение сохраняется на постоянном уровне и отношение концентрацииомепразола к концентрации метаболита в моче остается неизменным.Известно, что период полувыведения у омепразола составляет около 60минут, тем не менее, терапевтический эффект обусловлен не наличием должнойконцентрации в плазме крови, а необратимым блокированием фермента, и64прекращается при расщеплении заблокированных протонных помп и встраиваниивновь синтезированных молекул фермента в мембрану.
Время полужизнимолекулы протонной помпы в мембране составляет около 40 часов [Лопина О.Д.и др., 2016].Для хроматографирования полученных проб применяли колонку AgilentZorbax Eclipce Plus C18 RRHD 100 x 2,1 мм, 1,8 мкм с предколонкой AgilentZorbax Eclipce Plus C18 12,5 x 2,1 мм, 5 мкм. С целью разделения исследуемыханалитов было необходимо разработать методику градиентного элюирования.Были опробованы различные составы подвижной фазы (ацетонитрил: 0,1%раствор муравьиной кислоты в воде, метанол: фосфатный буфер (pH=5,4), 0,1%раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле: 0,1% раствор муравьиной кислоты вводе).В Таблице 2.17 приведены хроматографические условия разработаннойметодики.Таблица 2.17Хроматографические условия для определения омепразола и5-гидроксиомепразола в мочеПараметрУсловияХроматограф:Agilent 1290 InfinityКолонка:Agilent Eclipse XDB-C18, 2,1*50 мм, 1,8 мкмРежимработы 50 ºСтермостатаколонкиПодвижная фаза:Компонент А: раствор 5 мМ аммония формиата в 0,01%растворе муравьиной кислоты в водеКомпонент B: 0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитрилеСкоростьпотока 0,4 мл/минподвижной фазы:65Элюирование:ГрадиентноеВремя,Компонент А, % (V/V) Компонент В, % (V/V)минОбъем090101,59010280408,5307012955149010вводимой 10 мклпробы:ПриблизительныеОмепразол – 3,5;времена5-гидроксиомепразол – 4,3удерживаниякарбамазепин (внутренний стандарт) – около 7,2;исследуемыхвеществ, мин:Время анализа:Параметры14 минмасс- Ионизация: ESIдетектирования:Напряжение на капилляре: 3500 ВТемпература ионной трубки: 350°СТемпература ионизационной камеры: 400°СВспомогательный газ: 10 л/минГаз периферийного слоя: 11 л/минСметающий газ: 3 л/минДавление газа в ячейке соударений: 2,0 мТорр66Параметры MRM-Аналитпереходов:ПолярИон-Дочер-Энергияностьпрекурсорний ионсоударения,(m/z)(m/z)В+346,1346,130+362,1362,130+237,1194,030Омепразол5гидроксиомепразолКарбамазепин (ВС)МетаболическаяактивностьизоферментаоцениваласьCYP2C19поотношению концентрации основного метаболита 5-гидроксиомепразола, которыйобразуется под действием CYP2C19, к омепразолу в моче.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
